骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)急性心肌梗死中血管內(nèi)皮功能及心功能的影響

張凌云

急性心肌梗死是心血管疾病中較常見(jiàn)的病種，近年來(lái)其發(fā)病率和病死率居高不下并趨于年輕化，心肌梗死后心肌細(xì)胞的丟失和心室重構(gòu)是導(dǎo)致心力衰竭和臨床死亡的主要原因。目前治療措施主要有:藥物治療、冠狀動(dòng)脈介入、冠狀動(dòng)脈旁路術(shù)等這些治療只能使梗死血管恢復(fù)再灌注，并不能恢復(fù)已經(jīng)壞死心肌功能，研究證明，心肌梗死區(qū)周?chē)男募〖?xì)胞雖可以發(fā)生分裂，但修復(fù)梗死心肌的能力有限。因此，細(xì)胞水平心肌成形術(shù)逐漸得到推廣:即用細(xì)胞移植的手段增加心肌細(xì)胞的數(shù)量，修復(fù)壞死的心肌，從而改善心功能，降低病死率，為心肌梗死的治療提供了新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2010年9月至2012年1月收治40例急性心肌梗死的患者的臨床資料，所有病例均符合急性心肌梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)為:(1)心電圖相鄰兩個(gè)胸前臂導(dǎo)聯(lián)ST段抬高≥0.2 mV，或至少兩個(gè)肢體導(dǎo)聯(lián)ST段抬高≥1 mm或相鄰導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)Q波，或新出現(xiàn)的左束支傳導(dǎo)阻滯;(2)冠狀動(dòng)脈造影術(shù):至少有一個(gè)冠狀動(dòng)脈主支或大分支完全閉塞;(3)缺血性胸痛持續(xù)時(shí)間≥30 min含服硝酸甘油無(wú)緩解;(4)實(shí)驗(yàn)室檢查:心肌酶肌酸激酶(CK)或其同工酶(CKMB)＞正常2倍以上，肌鈣蛋白I(TNI)升高(至少具備以上兩個(gè)條件)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)既往肺部疾病，結(jié)締組織病、腫瘤;(2)心肌梗死發(fā)病超過(guò)24 h入院者;(3)心肌梗死前1周內(nèi)用過(guò)他汀或抗炎藥者;(4)腎臟疾病、心功能不全病史及血液系統(tǒng)疾病;(5)炎性疾病、風(fēng)濕免疫性疾病;(6)有外傷或6個(gè)月內(nèi)經(jīng)歷過(guò)任何外科手術(shù)。其中男32例，女8例;年齡42～78歲，平均年齡(56±4)歲;治療時(shí)間2～21 h，平均(8.9±2.2)h。吸煙者25例，其中合并高血壓病22例，高血脂20例，糖尿病15例。所有患者均簽署知情同意書(shū)，愿意參加本研究。將該40例心肌梗死的患者按照是否采用干細(xì)胞移植分為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植組(移植組)和急診經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(PCI)組及正常組，每組20例，同時(shí)選取我院進(jìn)行健康體檢者20例作為正常組，其中男15例，女5例;年齡42～78歲，平均年齡(56±4)歲。3組患者在年齡比、性別、病程、既往史、合并癥等一般資料方面具有可比性(P＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)治療:移植組與PCI組均給予常規(guī)藥物治療，給予阿司匹林100 mg/d、辛伐他汀(40 mg/d)或阿托伐他汀(20 mg/d)，每日晚口服1次;噻氯吡啶(50 mg/d)，餐時(shí)口服;低分子肝素鈉5 000 U每12小時(shí)1次，臍周皮下注射。同時(shí)采用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)、硝酸酯類藥物、β受體阻滯劑、鈣離子拮抗劑等藥物治療。

1.2.2 干細(xì)胞移植:①干細(xì)胞的采集和分離:在患者冠狀動(dòng)脈造影術(shù)前4 h，于髂后上棘對(duì)患者進(jìn)行局部麻醉，在無(wú)菌條件下多點(diǎn)穿刺抽取骨髓液100～120 ml加肝素6 000 U抗凝，然后移至營(yíng)養(yǎng)液的血漿袋內(nèi)，0℃保存，按照密度梯度離心法進(jìn)行分離，將所得液體按1∶4比例6%羥乙基淀粉加入靜置30 min，將沉降的紅細(xì)胞棄去，留取上清夜在放入低溫的低速離心機(jī)中以800 r/min進(jìn)行離心10 min，將離心后液體棄上清夜按照1∶1加入淋巴分離液，然后以2 000 r/min離心20 min，留取分離后的骨髓單個(gè)核細(xì)胞分離液12～15 ml，然后進(jìn)行培養(yǎng)、接代，［細(xì)胞達(dá)到1×(106～107)/ml進(jìn)行培養(yǎng)4～5 d細(xì)胞量達(dá)到90%融合時(shí)進(jìn)行傳代，傳至3代BMMNC按1×107/ml移至無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)袋］置于4℃下進(jìn)行保存，備用。取樣進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、微生物檢查，檢測(cè)到細(xì)胞總數(shù)為(1.4±0.4)×109個(gè)，所有細(xì)胞懸液均未見(jiàn)有細(xì)菌生長(zhǎng)，流式細(xì)胞儀進(jìn)行、CD133細(xì)胞含量分析，檢測(cè)到定細(xì)胞為(1.78±0.21)×105個(gè)。CD133為(0.44±0.15)×105之后轉(zhuǎn)移至導(dǎo)管室置于4℃?zhèn)湟浦彩褂?。②骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的注入:采用經(jīng)導(dǎo)管冠狀動(dòng)脈內(nèi)注入，冠狀動(dòng)脈造影后，將指引導(dǎo)管置于左冠狀動(dòng)脈開(kāi)口處，在0.014 F導(dǎo)絲指引下，將over-the-wire球囊(將直徑1.5～2.0 mm，長(zhǎng)度10 m)置于前降支支架遠(yuǎn)端，抽出導(dǎo)絲給6 atm將球囊充盈阻斷前降支血流，通過(guò)導(dǎo)管的中心腔分4～5次緩慢將骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液1×107/ml注入靶血管遠(yuǎn)端，每次推注時(shí)間2 min，反復(fù)共3次。期間觀察患者的癥狀、血壓、心電圖和冠狀動(dòng)脈血流等變化。細(xì)胞移植時(shí)間均在血管再通后7～14 d進(jìn)行。

1.2.3 血漿標(biāo)本的采集:分別于急診PCI術(shù)前或細(xì)胞移植術(shù)前、干細(xì)胞移植術(shù)后24 h、移植術(shù)后1、3、6個(gè)月時(shí)抽取靜脈血4 ml，PCI組于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)采血，4 h內(nèi)處理標(biāo)本。常溫3 000 r/min離心10 min，留取上層血清置于-80℃冰箱保存待測(cè)。

1.2.4 指標(biāo)的檢測(cè):測(cè)移植組、PCI組和正常組的可溶性細(xì)胞間黏附分子(SICAM-1)、可溶性血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(SVCAM-1)、SE-選擇素(SE-selection)這些指標(biāo)的測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附法實(shí)驗(yàn)方法操作，并觀察移植組和PCI組治療前后的心功能變化。

1.2.5 心功能檢測(cè)

1.2.5.1 射血分?jǐn)?shù)(EF):彩色多普勒超聲儀器為索諾聲MICROMAXX，S4經(jīng)胸探頭，融合頻率2～4 MHz，檢查時(shí)患者取左側(cè)臥位，沿胸骨左緣聲窗探查，以雙平面Simpson法測(cè)量LVEF值，檢測(cè)時(shí)由專人操作，所有數(shù)據(jù)均重復(fù)測(cè)量3次，取其平均值。

1.2.5.2 6min步行試驗(yàn):實(shí)驗(yàn)參照Vera Bittner報(bào)道的方法進(jìn)行，試驗(yàn)場(chǎng)所為30 m的直走長(zhǎng)廊，兩端各置一椅作為標(biāo)志。避免外界干擾，患者在其間往返走動(dòng)，步履緩急由患者根據(jù)自己的體能決定，囑患者盡最大可能行走，在6 min內(nèi)走完其其走完的最遠(yuǎn)的距離。每2分鐘由在旁監(jiān)測(cè)的人員報(bào)時(shí)1次，并記錄患者可能發(fā)生的氣促、胸痛等不適。如患者體力難支可暫時(shí)休息或中止試驗(yàn)。運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)前及運(yùn)動(dòng)后，記錄心率、血壓及呼吸頻率，監(jiān)測(cè)生命體征，所有數(shù)據(jù)均重復(fù)測(cè)量3次，取其平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示;多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組SICAM-1，SVCAM-1和SE-selection水平比較(1)移植組術(shù)前與PCI組術(shù)前SICAM-1、SVCAM-1、SE-selection含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，均顯著高于正常組(P＜0.05);(2)移植組與PCI組術(shù)后24 h，SICAM-1、SVCAM-1、SE-selection含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但略低于其術(shù)前，高于正常組(P＜0.05);(3)1個(gè)月、3個(gè)月后移植組與PCI組SICAM-1、SVCAM-1、SE-selection的含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，且2組均顯著低于術(shù)前，高于正常組(P＜0.05);(4)6個(gè)月后，移植組SICAM-1、SVCAM-1、SE-selection含量顯著低于PCI組(P＜0.05)，且2組均顯著低于術(shù)前(P＜0.05)，且均高于正常組(P＜0.05)。見(jiàn)表1～3。

表1 3組SICAM-1水平比較n=20，ng/ml，±s

表1 3組SICAM-1水平比較n=20，ng/ml，±s

注:與正常組比較，*P＜0.05;與PCI組比較，#P＜0.05

移植組術(shù)前139±13743±26*742.45±21.43組別 正常組PIC組*術(shù)后24 h-654±34*639.67±45.51*術(shù)后1個(gè)月 -532±32*443.43±31.76*#術(shù)后3個(gè)月 -432±12*327.56±9.12*#術(shù)后6個(gè)月 -320±9*165.11±7.21*#

表2 3組SVCAM-1水平比較n=20，ng/ml，±s

表2 3組SVCAM-1水平比較n=20，ng/ml，±s

注:與正常組比較，*P＜0.05;與PCI組比較，#P＜0.05

移植組術(shù)前339±15677±18*669.12±27.45組別 正常組PIC組*術(shù)后24 h-643±14*636.38±15.75*術(shù)后1個(gè)月 -533±18*428.92±11.34*#術(shù)后3個(gè)月 -456±20*323.45±11.08*術(shù)后6個(gè)月 -369±13*244.45±12.45*#

表3 3組SE-selection水平比較n=20，ng/ml，±s

表3 3組SE-selection水平比較n=20，ng/ml，±s

注:與正常組比較，*P＜0.05;與PCI組比較，#P＜0.05

移植組術(shù)前13±472.1±5.3*72.0±6.12組別 正常組PIC組*術(shù)后24 h-66.3±3.1*65.3±2.32*術(shù)后1個(gè)月 -56.4±3.6*42.3±5.78*#術(shù)后3個(gè)月 -44.9±8.3*31.0±3.53*#術(shù)后6個(gè)月 -26.3±4.3*20.8±1.12*#

2.2 3組EF和6 min行走試驗(yàn)比較EF和6 min行走試驗(yàn)1個(gè)月和3個(gè)月后，移植組與PCI組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，且2組均顯著低于正常組(P＜0.05);6個(gè)月后，移植組顯著高于PCI組(P＜0.05)，且均低于正常組(P＜0.05)。見(jiàn)表4、5。

表4 3組EF水平比較n=20，%，±s

表4 3組EF水平比較n=20，%，±s

注:與正常組比較，*P＜0.05;與PCI組比較，#P＜0.05

移植組術(shù)前62±935±6*34±7組別 正常組PIC組*術(shù)后1個(gè)月 -36±8*36±10*術(shù)后3個(gè)月 -40±7*42±9*術(shù)后6個(gè)月 -43±6*50±7*#

表5 移植組與PCI組6 min試驗(yàn)比較n=20，m，±s

表5 移植組與PCI組6 min試驗(yàn)比較n=20，m，±s

注:與正常組比較，*P＜0.05;與PCI組比較，#P＜0.05

移植組術(shù)前432±16222±42*219±40組別 正常組PIC組*術(shù)后1個(gè)月 -306±54*309±56*術(shù)后3個(gè)月 -336±51*342±54*術(shù)后6個(gè)月 -357±33*391±50*#

3 討論

心梗后心力衰竭是心血管疾病致死的常見(jiàn)病因，其病變主要是因?yàn)楣跔顒?dòng)脈血供急劇減少或是中斷引起的，冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重閉塞以后導(dǎo)致了急性缺血發(fā)生，缺血嚴(yán)重后心肌梗死細(xì)胞有少量組織分裂增生發(fā)生，發(fā)生分裂增生的細(xì)胞數(shù)量不大，所以這些修復(fù)細(xì)胞并不能完整的修復(fù)心肌組織［1，2］。目前認(rèn)為對(duì)心肌梗死患者最有效的治療是保護(hù)和增加具有收縮功能的心肌細(xì)胞。因此研究認(rèn)為需要尋找一種新的方法來(lái)治療心肌梗死，目前認(rèn)為干細(xì)胞可以自體繁殖，而且對(duì)于身體器官里的各種器官都可以起到新的修復(fù)作用，對(duì)于心肌梗死的病情有很大的幫助，隨著對(duì)干細(xì)胞研究的深入，將干細(xì)胞植入受損心肌組織中分化為心肌細(xì)胞，以替代壞死心肌改善心功能為心肌梗死的治療提供了一種新思路［3，4］，受到了廣泛關(guān)注。

3.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)內(nèi)皮功能的影響 血管內(nèi)皮細(xì)胞可以產(chǎn)生和分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1、ICAM-1、E-selection等幾十種生物活性物。這些生物活性物質(zhì)能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞之間，細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)之間相互結(jié)合，起到的黏附作用能夠令細(xì)胞表面參與介導(dǎo)，在動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中，細(xì)胞黏附在血管內(nèi)皮中，并且向著血管內(nèi)皮下行移動(dòng)，然后慢慢的衍化成為巨噬細(xì)胞，攝取脂質(zhì)，這些內(nèi)皮細(xì)胞上的黏附分子即ICAM-1、VCAM-1、E-selection，他們均屬于細(xì)胞黏附分子中免疫球蛋白超家族，參與不同細(xì)胞間的識(shí)別和黏附。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三種內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子在干細(xì)胞移植術(shù)后的降低說(shuō)明干細(xì)胞移植可通過(guò)下調(diào)黏附分子的表達(dá)，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的功能，防止病情進(jìn)展。

3.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)心功能的影響(1)移植的MSCs對(duì)于心室擴(kuò)張和重建有著很大的治療價(jià)值，其作用機(jī)制是通過(guò)肌纖維的彈性來(lái)限制心室擴(kuò)張，這樣就能夠有效避免了心肌細(xì)胞的繼續(xù)受損，而且能夠?qū)τ诎毯蹍^(qū)有一定的增厚性，這樣就可以堆心肌收縮性有所改善;(2)EF值是反映左心室收縮功能的指標(biāo)，6 min步行試驗(yàn)是評(píng)價(jià)心功能的次級(jí)量運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)，本研究通過(guò)檢測(cè)患者的在干細(xì)胞移植術(shù)后的射血分?jǐn)?shù)變化，并通過(guò)6 min步行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雖然移植組的患者在住院期間及術(shù)后3個(gè)月的EF和6 min步行試驗(yàn)距離與單純PCI組的患者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。但移植組術(shù)后6個(gè)月患者的射血分?jǐn)?shù)和6 min步行試驗(yàn)距離顯著優(yōu)于對(duì)照組(P＜0.05)。這說(shuō)明干細(xì)胞移植顯著改善了患者的心功能。

本研究時(shí)間較短，未進(jìn)行長(zhǎng)期跟蹤隨訪，無(wú)法觀察到患者有無(wú)并發(fā)癥及不良反應(yīng)的發(fā)生。由于多種原因，本研究的樣本量不大。干細(xì)胞移植為心肌梗死的治療提供了一種新思路。

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