水通道蛋白-4抗體陽性患者血清抗Hu、Yo抗體的檢測

龍友明 單福蘭 解龍昌 陳夢(mèng)宇 鄭楊波 高聰 楊寧

視神經(jīng)脊髓炎(Neuromyelitis optica, NMO)免疫球蛋白G(NMO-IgG)的發(fā)現(xiàn)源于腫瘤患者血清中副腫瘤綜合征抗體的篩查[1]。NMO-IgG實(shí)質(zhì)是水通道蛋白-4(aquaporin-4, AQP4)抗體[2]，即AQP4抗體，是區(qū)分NMO與多發(fā)性硬化的特異性標(biāo)記物[3-4]。研究表明，AQP4抗體不僅出現(xiàn)于NMO、視神經(jīng)炎、脊髓炎患者，亦可見于其他疾病，包括無視神經(jīng)炎、脊髓炎的腫瘤患者[1]。副腫瘤綜合征是原發(fā)性惡性腫瘤對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和/或骨骼肌遠(yuǎn)隔效應(yīng)所引起的一組臨床癥狀群，抗Hu抗體和抗Yo抗體是其最常見的標(biāo)志物。AQP4抗體發(fā)現(xiàn)者Pittock等認(rèn)為在某些NMO患者中，AQP4抗體本身也是副腫瘤免疫反應(yīng)的標(biāo)志物[1]。但目前尚無進(jìn)一步的研究顯示抗Hu抗體和抗Yo等抗體在AQP4抗體陽性的患者中出現(xiàn)。本研究旨在觀察抗Hu抗體和抗Yo抗體在80例AQP4抗體陽性的患者出現(xiàn)情況并分析其臨床意義。

1 對(duì)象和方法

1.1觀察對(duì)象收集2012-10-2013-07在作者醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科檢測AQP4抗體陽性的患者80例，其中男5例、女75例，中位起病年齡38歲(16～73歲)，59例(73.7%)符合2006年NMO的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]， 2例(2.5%)診斷為復(fù)發(fā)性視神經(jīng)炎[3]，13例(16.3%)診斷為長節(jié)段脊髓炎(脊髓連續(xù)病灶長度在MRI上超過3個(gè)脊椎節(jié)段)[3,5]，其余6例(7.5%)患者表現(xiàn)為孤立的腦干綜合征[6]。其中僅1例(1.25%)復(fù)發(fā)性長節(jié)段脊髓炎患者有明確晚期結(jié)腸癌。

1.2方法猴小腦的冰凍切片和抗Hu、Yo抗體的標(biāo)準(zhǔn)液，AQP4抗體的檢測試劑盒(HEK-293細(xì)胞)，均購自德國EUROIMMUN公司。

1.2.1AQP4抗體檢測：所有的患者都接受AQP4抗體的檢測。參考文獻(xiàn)[7]的方法：(1)10 μL待測血清加入PBS液90 μL稀釋(1∶10)；(2)將25 μL稀釋后的待測血清樣本加至加樣板的反應(yīng)區(qū)，蓋上包被有轉(zhuǎn)染和非轉(zhuǎn)染AQP4基因細(xì)胞的玻片，室溫育30 min；(3)PBS沖洗1次，并浸泡5 min；(4)取20 μL FITC標(biāo)記的抗人IgG，加入加樣板，重復(fù)(2)、(3)步驟后封片，于20倍熒光顯微鏡下觀察上述細(xì)胞是否存在綠色熒光。結(jié)果判斷：陽性細(xì)胞的胞漿和胞膜出現(xiàn)明顯的熒光模式(細(xì)胞核不染色)，而陰性細(xì)胞不出現(xiàn)任何熒光視為陽性，否則視為陰性結(jié)果。

1.2.2Hu、Yo抗體檢測：猴小腦冰凍切片，PBS液沖洗5 min×1；加入1∶60稀釋的患者血清，室溫下結(jié)合30 min，PBS沖洗3 min×2；加用熒光素結(jié)合的羊抗人IgG的抗體，結(jié)合30 min，PBS沖洗3 min×2，甘油-PBS液封片，于20倍熒光顯微鏡下觀察小腦切片的顆粒層和分子層神經(jīng)元。以抗Hu抗體及抗Yo抗體的標(biāo)準(zhǔn)液替代血清作陽性對(duì)照，以PBS液替代血清作陰性對(duì)照。小腦灰質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞核呈現(xiàn)顆粒狀熒光為抗Hu抗體陽性；小腦普肯耶細(xì)胞形成粗顆粒狀染色為抗Yo抗體陽性。

2 結(jié)果

80例患者抗Hu抗體均陰性，僅1例NMO患者出現(xiàn)典型的血清Yo抗體，抗體結(jié)合于猴小腦的顆粒層普肯耶(Purkinje)細(xì)胞，呈特異性熒光模式，抗體滴度為1∶3840。

該抗Yo抗體陽性患者為女性，起病年齡為17歲，病程1年余，無惡性腫瘤病史，2011-10無誘因突發(fā)左側(cè)視力下降，只有光感，當(dāng)時(shí)診斷為視神經(jīng)炎，外院應(yīng)用甲潑尼龍治療后視力恢復(fù)至眼前指數(shù)。2012-02突發(fā)雙下肢無力和二便障礙，MRI檢查提示頸1～頸3和頸6～胸2脊椎節(jié)段的長病灶(圖1)，頭顱MRI未見異常。HEK-293細(xì)胞檢測血清中AQP4抗體陽性(抗體滴度1∶1000，圖2A)，血清Yo抗體陽性(1∶3840，圖2B)，患者還存在沉積于腎小球的其他不明抗體(圖2C)?；颊呓?jīng)甲潑尼龍沖擊后，遺留左側(cè)肢體無力，肌力約Ⅴ-級(jí)。目前EDSS評(píng)分為4分。

圖1一例NMO患者的MRI表現(xiàn)：T1加權(quán)的脊髓增強(qiáng)可見長節(jié)段的頸髓與胸髓病灶(箭頭所示)

A：HEK-293細(xì)胞結(jié)合間接免疫熒光法提顯示AQP4抗體陽性(箭頭所示；×20)；B：猴小腦冰凍切片結(jié)合間接免疫熒光檢測提示血清中抗體結(jié)合于小腦的Purkinje細(xì)胞(箭頭所示，×20)，為特征性的Yo抗體； C：患者血清中有不明抗體結(jié)合于腎小球(箭頭所示；間接免疫熒光×40)

圖2一例NMO患者的自身抗體檢測結(jié)果

3 討論

AQP4抗體是Lennon等發(fā)現(xiàn)的一種NMO疾病特異性的抗體，對(duì)NMO與MS的鑒別具有重要的意義[2]。進(jìn)一步研究顯示AQP4抗體具有致病性[8]：AQP4抗體與星形細(xì)胞終足、朝向微血管腔內(nèi)面的AQP4結(jié)合，通過抗體依賴性細(xì)胞毒作用和補(bǔ)體依賴性粒細(xì)胞募集殺傷星形細(xì)胞，從而啟動(dòng)后續(xù)的炎性反應(yīng)，導(dǎo)致髓鞘脫失及組織壞死[9]。AQP4抗體最早發(fā)現(xiàn)于近20萬份腫瘤患者的副腫瘤綜合征抗體(抗Hu、Yo抗體等)的篩查過程中，提示副腫瘤綜合征抗體與AQP4抗體具有一定關(guān)聯(lián)性[1]。在5萬份檢測AQP4抗體的患者血清中，陽性患者3587例(7%)，并非全部合并脊髓炎和/或視神經(jīng)炎，提示AQP4抗體本身不但是NMO的診斷標(biāo)記物和致病因子，而且可能是腫瘤免疫反應(yīng)的產(chǎn)物[1]。因此，AQP4抗體可能也是反映副腫瘤綜合征的一種抗體，它的出現(xiàn)可能有助于防止腫瘤進(jìn)一步的擴(kuò)散[1]。本研究中，80例AQP4抗體陽性的患者中只有1例患者有晚期結(jié)腸癌的病史，尚不能確定AQP4抗體與結(jié)腸癌的發(fā)生具有必然的因果關(guān)系。惡性腫瘤患者出現(xiàn)視神經(jīng)脊髓癥狀[10]或神經(jīng)系統(tǒng)的其他表現(xiàn)，如肌無力綜合征、腦干腦炎等，臨床醫(yī)生通?？紤]副腫瘤綜合征可能。但是，根據(jù)目前對(duì)NMO的認(rèn)識(shí)，AQP4抗體陽性的患者常需要免疫抑制治療，因此，AQP4抗體陽性的惡性腫瘤患者診斷歸類為視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病為宜[6,11]，當(dāng)AQP4抗體陰性時(shí)醫(yī)生應(yīng)考慮副腫瘤綜合征可能[10]，并檢測其他抗體來證實(shí)?？梢姡瑱z測AQP4抗體有助于區(qū)分其他副腫瘤綜合征抗體引起的NMO樣病變。

副腫瘤綜合征是原發(fā)性惡性腫瘤對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和/或骨骼肌遠(yuǎn)隔效應(yīng)所引起的一組臨床癥狀群，其發(fā)病與腫瘤免疫產(chǎn)生的自身抗體有關(guān)[12]。目前已證實(shí)多種抗體可以出現(xiàn)在副腫瘤綜合征中，包括抗Hu、Yo、Ma2、CRMP-5、amphiphysin和Ri抗體[13]，以抗-Hu和 Yo抗體最常見，前者多見于小細(xì)胞肺癌，后者多見于婦科腫瘤或乳腺癌患者[14]。盡管AQP4抗體的發(fā)現(xiàn)源自于副腫瘤綜合征抗體的檢測，但是還沒有相關(guān)的研究探討血清AQP4抗體陽性的患者是否出現(xiàn)副腫瘤綜合征抗體。本研究中，通過目前最靈敏和特異的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法[7]篩查了80例AQP4抗體陽性的患者，然后以標(biāo)準(zhǔn)的猴小腦冰凍切片的免疫熒光方法篩查抗Hu、抗Yo抗體[14]。參考標(biāo)準(zhǔn)的陽性對(duì)照，本組中無抗Hu抗體的出現(xiàn)，僅有1例患者出現(xiàn)抗Yo抗體，且該患者無腫瘤病史。本組80例中79例均無腫瘤病史，提示了抗Hu、抗Yo抗體在無腫瘤史的AQP4抗體陽性的患者中比較少見。由于缺乏腫瘤患者的該抗體檢測的大樣本研究，尚不能明確腫瘤患者中該抗體的陽性率情況。本次檢測中，1例NMO患者抗Yo抗體陽性的臨床意義也不能明確。抗-Yo抗體是特異性抗普肯耶細(xì)胞抗體，出現(xiàn)于合并副腫瘤小腦變性的乳腺癌、卵巢癌或子宮癌病患者。經(jīng)免疫組化顯示其靶抗原為普肯耶細(xì)胞的一種顆粒性胞漿標(biāo)記物，經(jīng)Western-blot法已證實(shí)相對(duì)分子質(zhì)量34 000及62 000兩種已被克隆的抗原[12]。在超過半數(shù)的副腫瘤小腦變性病例中，神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)常出現(xiàn)于發(fā)現(xiàn)癌腫之前，特征性表現(xiàn)為進(jìn)展性共濟(jì)失調(diào)、構(gòu)音障礙和眼球震顫，MRI可見廣泛小腦萎縮。本患者并無上述臨床特征和惡性腫瘤的證據(jù)，因此可排除副腫瘤小腦變性?，F(xiàn)已證實(shí)NMO患者常出現(xiàn)器官特異或非特異性自身抗體[15]，本研究中該患者出現(xiàn)靶抗原不明的腎小球自身抗體亦符合該病的特點(diǎn)。因此，長期隨訪患者的臨床癥狀和追蹤其是否出現(xiàn)婦科或乳腺惡性腫瘤有助于了解Yo抗體的真正的臨床意義。

綜上所述，本研究顯示，80例AQP4抗體陽性患者中，僅1例出現(xiàn)副腫瘤綜合征相關(guān)的抗Yo抗體，未發(fā)現(xiàn)抗Hu抗體，進(jìn)一步大樣本檢測和長期隨訪副腫瘤綜合征抗體陽性的NMO及其譜系疾病有助于了解副腫瘤綜合征與AQP4抗體的關(guān)系。

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