激光粒度儀測(cè)定浮游植物粒徑的可行性研究

劉冬燕古濱河高 俊柳云龍

(1. 上海師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)系, 上海 200234; 2. 上海師范大學(xué)城市生態(tài)與環(huán)境研究中心, 上海 200234; 3. 暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系, 廣州510063)

激光粒度儀測(cè)定浮游植物粒徑的可行性研究

劉冬燕1,2古濱河3高 俊2柳云龍2

(1. 上海師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)系, 上海 200234; 2. 上海師范大學(xué)城市生態(tài)與環(huán)境研究中心, 上海 200234; 3. 暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系, 廣州510063)

不同粒級(jí)大小的浮游植物有著不同的生態(tài)學(xué)意義,粒度基本上反映了從低營(yíng)養(yǎng)級(jí)到高營(yíng)養(yǎng)級(jí)間的生物量、能量等各種關(guān)系。生態(tài)系統(tǒng)中的能流分配, 在很大程度上取決于生物顆粒的大小, 以粒徑大小作為標(biāo)準(zhǔn)能夠簡(jiǎn)化食物網(wǎng), 克服浮游植物在物種分類上的局限, 使浮游植物群落乃至浮游生態(tài)系統(tǒng)的研究擺脫物種間復(fù)雜相互關(guān)系的阻拌, 能促進(jìn)浮游生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)與能量研究[1]。

浮游植物的粒徑測(cè)量方法有多種, 如顯微測(cè)微計(jì)法、葉綠素分級(jí)法、庫(kù)爾特計(jì)數(shù)法、流式細(xì)胞儀法和激光粒度分析法等[2]。顯微測(cè)微計(jì)法是測(cè)量浮游植物粒徑的經(jīng)典和基準(zhǔn)方法[3], 具有直觀的優(yōu)點(diǎn), 但其工作量大, 耗時(shí)多,不能形成連續(xù)的粒徑譜, 也不適用于浮游生物的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè); 葉綠素分級(jí)法, 以下簡(jiǎn)稱分級(jí)法, 是浮游生物粒徑研究最常用的方法之一, 此法需要萃取葉綠素, 檢測(cè)速度慢, 所得粒徑只有有限的幾個(gè)等級(jí), 得到的結(jié)果較粗略和籠統(tǒng)[4]; 庫(kù)爾特計(jì)數(shù)法可直接測(cè)量顆粒物體積及其分布, 但其粒徑測(cè)量范圍一般為1—120 μm, 測(cè)量結(jié)果可能偏低[5,6]; 流式細(xì)胞法可以檢測(cè)以浮游植物為主的含有葉綠素的顆粒, 分選出不同的生態(tài)類群, 是研究浮游植物群落結(jié)構(gòu)的一種重要手段[7—9], 但目前一般流式細(xì)胞儀的最佳檢測(cè)范圍是 0.5—20 μm, 對(duì)于較大的顆粒難以操作, 不同種類浮游植物所需不同染色劑之間相互干擾,前處理中會(huì)損失部分細(xì)胞, 易受外界干擾, 很難進(jìn)行船載現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

隨著科技的發(fā)展, 粒徑自動(dòng)化測(cè)量將是粒徑研究的趨勢(shì)之一, 浮游植物粒徑分析的新技術(shù)有HPLC 技術(shù)、熒光顯微技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)、聲學(xué)測(cè)量技術(shù)、圖像分析技術(shù)以及光學(xué)測(cè)量技術(shù)等[5,6,10—12]。但這些技術(shù)大多都還處于探索階段, 在測(cè)定粒徑組成時(shí)需要確定各種方法的可行性和精準(zhǔn)性。

如上所述, 測(cè)量浮游植物粒徑的方法有多種,但這些方法不是步驟繁瑣, 就是受人為因素影響大, 或者測(cè)定的范圍有限, 難以進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè), 或者技術(shù)不成熟, 尚處于探索階段。激光粒度分析法(以下簡(jiǎn)稱激光法)克服了傳統(tǒng)測(cè)量方法的局限性, 具有測(cè)量速度快、動(dòng)態(tài)范圍大、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn), 能給出詳細(xì)的粒度分布情況, 但它不能區(qū)分生物顆粒和非生物顆粒[13]。因此,能否用激光粒度技術(shù)來(lái)測(cè)定浮游植物粒徑分布還處于探索階段, 本文利用葉綠素分級(jí)法與激光粒度分析法分別測(cè)定浮游植物粒徑, 對(duì)比兩種方法間的差異與相關(guān)度,以探討激光法測(cè)定浮游植物粒徑的可行性。

1 材料與方法

于2012年在上海師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系調(diào)節(jié)池中采4個(gè)平行水樣, 每次約90 L, 每隔4天采一次, 用激光粒度儀和分級(jí)法分別進(jìn)行浮游植物粒徑測(cè)定。

1.1 激光粒度法

先對(duì)藻類進(jìn)行固定: 取2000 mL水樣用200 μm分樣篩過(guò)濾, 以去除大型浮游動(dòng)物活動(dòng)對(duì)浮游植物的影響;濾液置于燒杯中, 加入30 mL魯哥氏液并搖勻, 靜置24h,用虹吸管吸去部分上清液, 轉(zhuǎn)入500 mL的分液漏斗中靜置 24h, 用虹吸管吸去上清液, 將下層沉淀混合液移入具塞試管中備用。

測(cè)定前手動(dòng)搖勻備用水樣, 以將原始樣品分散成單顆粒。設(shè)置數(shù)據(jù)輸出為0.2—2、2—20、20—200 μm三檔, 用Beckman Coulter的LS13320型臺(tái)式激光粒度分析儀測(cè)定, 并測(cè)量其中位數(shù)與平均值。

1.2 葉綠素分級(jí)法

本文按照國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn)將浮游植物分為網(wǎng)采浮游植物(Netphytoplankton, 20—200 μm, 以下記NET-); 微型浮游植物(Nanophytoplankton, 2—20 μm, 以下記NANO-); 微微型浮游植物(Picophytoplankton, 0.2—2 μm, 以下記PICO-)。

取3000 mL左右的水樣, 用200 μm分樣篩過(guò)濾, 以去除大型浮游動(dòng)物活動(dòng)對(duì)浮游植物的影響。在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分級(jí), 用20 μm分樣篩過(guò)濾, 所得水樣再用2 μm混合纖維濾膜抽濾, 得＜200 μm、＜20 μm、＜2 μm的水樣。各分級(jí)水樣分別經(jīng)濾紙(Whatman GF/C)過(guò)濾, 用分光光度法分別測(cè)定各粒級(jí)的葉綠素 a含量[14], 以差減法得 20—200、2—20、0.2—2 μm三個(gè)粒級(jí)的浮游植物葉綠素a含量, 利用百分比法計(jì)算得各粒級(jí)的百分比。

2 結(jié)果

2.1 激光法和分級(jí)法所測(cè)得 NET、NANO、PICO粒級(jí)百分比均值及標(biāo)準(zhǔn)誤

從圖1可見, 分級(jí)法與激光粒度法測(cè)得的NET粒級(jí)百分比均值在2月14日、2月24日以及4月4日有差異,其他時(shí)間結(jié)果較一致; NANO粒級(jí)百分比均值在3月5日和3月20日有所差距,其他時(shí)間結(jié)果較一致; 而對(duì)于PICO粒級(jí)百分比均值, 激光粒度法所測(cè)得的普遍要比用分級(jí)法所測(cè)的結(jié)果高, 除了2月14日和3月20日比較一致外,其他時(shí)間結(jié)果不一致。

2.2 激光粒度法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的重復(fù)性

利用激光粒度儀對(duì)同一樣品進(jìn)行 10次測(cè)試, 測(cè)定其PICO粒級(jí)、NANO粒級(jí)以及NET粒級(jí)的百分比及其平均粒徑和中位粒徑, 并分別進(jìn)行方差分析, 各值的P值均大于0.05 (表1), 一般情況下, P＜0.01為非常顯著, 0.01＜P＜0.05為顯著, P＞0.05為無(wú)差異, 激光粒度儀所測(cè)各值均顯示為無(wú)差異, 表明激光粒度儀在測(cè)量樣品時(shí)的重復(fù)性好。

表1 激光粒度法所測(cè)各參數(shù)的方差分析Tab.1 Analysis of variance about each Parameter of Lazer Particle Size Analyzer

2.3 激光粒度法的其他測(cè)量結(jié)果

據(jù)圖 2左所示, 激光粒度法在實(shí)驗(yàn)初期(2月 5日至2月24日)所測(cè)得的平均粒徑值較小, 最小值僅3.61 μm, 3月份后平均粒徑值處在一個(gè)較高的水平上, 最高值達(dá)66.25 μm。中位粒徑的走勢(shì)和平均粒徑基本一致。

3 討論

3.1 激光粒度儀測(cè)定浮游植物粒徑的可行性

利用配對(duì) T檢驗(yàn)對(duì)分級(jí)法和激光法所測(cè)結(jié)果進(jìn)行差異性檢驗(yàn), 統(tǒng)計(jì)分析表明, 兩種方法所測(cè)得的 NET和NANO粒級(jí)沒(méi)有顯著差異(P＞0.05), 而PICO粒級(jí)有顯著差異(P＜0.05)(表2)。

利用相關(guān)分析對(duì)分級(jí)法和激光法進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn),結(jié)果表明, 兩種方法所得NET和NANO粒級(jí)百分比有極顯著相關(guān)(P＜0.01), 相關(guān)系數(shù)分別為0.533和0.543 (表2),說(shuō)明兩種粒徑測(cè)定方法對(duì)NET和NANO粒級(jí)的測(cè)定結(jié)果擬合度非常好。而兩種方法所得PICO粒級(jí)沒(méi)有顯著相關(guān)(P＞0.05), 相關(guān)系數(shù)為–0.036, 說(shuō)明兩種粒徑測(cè)定方法對(duì)PICO粒級(jí)的測(cè)定結(jié)果擬合度并不好。

如上可見, 對(duì)于NET和NANO粒級(jí), 兩種粒度法所測(cè)結(jié)果吻合度較好; 對(duì)于PICO粒級(jí)而言, 兩種粒度法所測(cè)PICO粒級(jí)的結(jié)果吻合度不好。另外, 激光法所測(cè)PICO粒級(jí)百分比要比分級(jí)法測(cè)得的值高(圖 1), 這可能是由于激光粒度法測(cè)定水樣中不僅包括浮游植物, 還包括細(xì)菌、有機(jī)顆粒與無(wú)機(jī)物顆粒等物質(zhì), 而這些物質(zhì)主要集中在0.2—2 μm的范圍, 因此激光法測(cè)得的PICO粒級(jí)百分比偏高。而分級(jí)法是采用濾紙過(guò)濾水樣, 濾紙有一定的孔徑,這樣會(huì)遺漏掉一些小于濾紙孔徑的微微型浮游植物, 另外, 分級(jí)法在研磨與樣品轉(zhuǎn)移等過(guò)程中也會(huì)人為損失一部分葉綠素, 因此, 用分級(jí)法測(cè)得的結(jié)果會(huì)偏小一些。兩種粒徑測(cè)定方法一個(gè)結(jié)果偏低, 一個(gè)結(jié)果偏高, 所得結(jié)果相關(guān)性不顯著也就可以理解, 因此, 無(wú)論是用激光粒度法還是用葉綠素分級(jí)法測(cè)定浮游植物 PICO粒級(jí)百分比時(shí)均需要謹(jǐn)慎。

圖 1 激光法和分級(jí)法所測(cè)NET、NANO、PICO粒級(jí)百分比均值及標(biāo)準(zhǔn)差Fig. 1 The Mean and Standard Deviation of NET, NANO and PICO size percentage by methods of Size-fractionated and Lazer Particle Size Analyzer

圖2 激光法所測(cè)中位粒徑和平均粒徑Fig. 2 The Median Size and Mean Size on methods of Lazer Particle Size Analyzer

3.2 激光粒度法和葉綠素分級(jí)法的比較

葉綠素分級(jí)法 利用葉綠素分級(jí)法測(cè)定浮游植物粒徑已得較普遍的應(yīng)用[14—16], 分級(jí)法最大的優(yōu)勢(shì)是不受水體其他懸浮顆粒物如有機(jī)碎屑與無(wú)機(jī)顆粒等的干擾,不僅能得到所選浮游植物粒徑的百分比值, 還能給出此粒徑浮游植物的葉綠素(生物量)含量, 測(cè)定結(jié)果能代表不同粒徑的浮游植物。但是, 分級(jí)法不能連續(xù)測(cè)定浮游植物的粒級(jí), 只能測(cè)定一定粒徑等級(jí)的浮游植物。這是因?yàn)楫?dāng)所需測(cè)定的粒徑等級(jí)多時(shí), 所需水樣量會(huì)大大增加, 尤其是微微型浮游植物, 由于數(shù)量少, 需要抽濾的水量多。如此一來(lái), 水樣的搬運(yùn)會(huì)十分吃力, 水樣抽濾也會(huì)耗費(fèi)較多的時(shí)間, 野外工作量及時(shí)間都會(huì)受到限制。因此, 對(duì)每個(gè)水樣進(jìn)行3次統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的重復(fù)性測(cè)試很少在研究中見到, 這也是為何葉綠素分級(jí)法一般只做3個(gè)等級(jí)的粒級(jí)測(cè)定的原因。其次, 分級(jí)法在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中步驟復(fù)雜, 樣品在不同容器間轉(zhuǎn)移次數(shù)多, 易造成葉綠素?fù)p失, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏低。目前看來(lái), 多數(shù)研究一般每個(gè)水樣只做一次,但測(cè)定時(shí)會(huì)重復(fù)測(cè)2—3次, 然而, 如前所述, 樣品只做一次容易發(fā)生傾倒或其他環(huán)節(jié)失誤而導(dǎo)致誤差增加。

表2 分級(jí)法和激光法測(cè)得各粒級(jí)百分比的配對(duì)T檢驗(yàn)與相關(guān)分析Tab. 2 Paired Samples T test and Correlation analysis of Size-fractionated and Lazer Particle Size Analyzer of all size percentage

激光粒度法 激光粒度分析方法是近年來(lái)發(fā)展較快的一種測(cè)試方法, 其測(cè)量的粒徑范圍廣, 測(cè)試速度快,操作簡(jiǎn)便, 減少了樣品的損失, 降低了標(biāo)準(zhǔn)偏差, 且具有受人為因素影響小, 測(cè)定結(jié)果重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)(表1), 能獲得所測(cè)水樣顆粒物的平均粒徑與中位粒徑(圖2), 可以連續(xù)測(cè)量任意粒級(jí)的浮游植物百分比, 獲得多等級(jí)以及連續(xù)的粒徑分布。激光粒度法在測(cè)定浮游植物較大的粒徑時(shí), 具有相當(dāng)強(qiáng)的可信度和精確度, 然而在低粒徑區(qū)域容易受到無(wú)機(jī)物顆粒的干擾, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)偏高。另外, 激光粒度法只能測(cè)量顆粒的百分含量, 無(wú)法解釋水體浮游植物的生物量狀況。因此, 就本研究所得結(jié)果看, 如果僅僅需要測(cè)量水樣中較大粒級(jí)浮游植物的百分比含量, 則激光粒度法不失為一種非常好的選擇。如果需要測(cè)定小顆粒百分比或浮游植物粒級(jí)生物量, 則需要配合其他的方法共同完成。

4 結(jié)語(yǔ)

從本研究結(jié)果看, 利用激光粒度法來(lái)測(cè)定浮游植物的NET和NANO粒級(jí)百分比是可行的。但是, 對(duì)于PICO粒級(jí)百分比而言, 利用激光粒度法測(cè)定所得結(jié)果偏高,而用分級(jí)法測(cè)得的結(jié)果則偏小一些。因此, 無(wú)論用激光粒度法還是用葉綠素分級(jí)法測(cè)定浮游植物 PICO粒級(jí)時(shí)均需要謹(jǐn)慎。

隨著科技的發(fā)展, 粒徑自動(dòng)化測(cè)量將是粒徑研究的趨勢(shì)之一, 利用激光粒度技術(shù)在進(jìn)行浮游植物粒徑研究時(shí)可以結(jié)合各種顆粒分類技術(shù), 同時(shí)應(yīng)用粒徑方法與分類方法, 以得到浮游植物的顆粒結(jié)構(gòu)。此外, 如果需要了解水體中浮游植物粒徑生物量的分布, 則需要將激光粒度自動(dòng)化技術(shù)與葉綠素分級(jí)法相結(jié)合, 由此可見, 雖然傳統(tǒng)的粒徑分析方法具有耗時(shí)、繁瑣的缺點(diǎn), 但是對(duì)研究具體粒徑范圍的信息是有意義的。因此, 應(yīng)該重視粒徑方法與傳統(tǒng)分類方法的結(jié)合。需要注意的是, 激光粒度分析中忽略了非生物顆粒物的影響。使用多種技術(shù)獲得的粒徑數(shù)據(jù)放在一起分析時(shí)需要考慮數(shù)據(jù)整合問(wèn)題, 不能簡(jiǎn)單的等同或者替代, 應(yīng)該重視新的粒徑測(cè)量手段應(yīng)用可能帶來(lái)的不利影響。關(guān)于如何建立非生物顆粒物影響的評(píng)估和校正方法問(wèn)題, 尚需尋找其他的粒徑分級(jí)方法以進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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A FEASIBILITY STUDY ON MEASURING PHYTOPLANKTON SIZE BY LASER PARTICLE SIZE ANALYZER

LIU Dong-Yan1,2, GU Bin-He3, GAO Jun2and LIU Yun-Long2
(1. Department of Environmental Science, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China; 2. Urban Ecology and Environment Research Centre, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China; 3. Department of Ecology, Jinan University, Guangzhou 510063, China)

激光粒度法; 葉綠素分級(jí)法; 浮游植物; 粒級(jí)

Laser particle size analyzer; Size-fractionated Chlorophyll-a; Phytoplankton; Size fraction

Q178.1

A

1000-3207(2014)06-1185-05

10.7541/2014.172

2013-11-12;

2014-05-11

國(guó)家自然科學(xué)基金(31170441; 31070419); 上海師范大學(xué)原創(chuàng)與前瞻性預(yù)研項(xiàng)目(DYL201304); 上海地方院校“十二五”內(nèi)涵建設(shè)項(xiàng)目; 國(guó)家環(huán)境保護(hù)局水專項(xiàng)之分項(xiàng)資助

劉冬燕(1969—), 女, 湖北監(jiān)利人; 博士; 主要從事浮游生物生態(tài)學(xué)方面的研究。E-mail: liudy@shnu.edu.cn

柳云龍, E-mail: liu_zju@126.com