PTEN與MMP-2在非小細(xì)胞肺癌中的臨床意義

鮑振學(xué) 毛桂玲 劉云云

PTEN(phosphatase and tensin homologue，PTEN)基因是一種具有雙特異性磷酸脂質(zhì)酶活性的抑癌基因，是一類與腫瘤的發(fā)生、增殖及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因，其在PI3K/PTEN/AKT信號通路中起關(guān)鍵性調(diào)控作用，PTEN基因的失活可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移中起到重要的作用。MMP-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)是Zn2+依賴性的內(nèi)源性的蛋白水解酶，參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)的方法，檢測了肺癌組織與相應(yīng)癌旁正常肺組織中PTEN、MMP-2蛋白的表達(dá)情況，分析其與肺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，探討PTEN、MMP-2在NSCLC中表達(dá)的意義及預(yù)后價值，為NSCLC的治療探索新途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2009至2012年確診為原發(fā)性支氣管肺癌手術(shù)切除標(biāo)本73例(肺癌組)，男36例，女37例;年齡33～73歲，平均57.6歲。所有標(biāo)本均經(jīng)HE染色病理證實。按照AJCC和UICC分期委員會1997年公布修訂的分期標(biāo)準(zhǔn)，鱗癌39例，腺癌34例;高分化25例，中分化26例，低分化22例;Ⅰ、Ⅱ期38例，Ⅲa、Ⅲb期35例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例。全部病例術(shù)前未接受過放療、化療。對照組73例取自對應(yīng)癌旁正常肺組織(距癌灶邊緣5 cm以外)。所有病例均有完整隨訪資料，隨訪截止日期為2012年12月，生存期的計算從手術(shù)日期到隨訪截止日期，或由于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而死亡的日期為止。

1.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測方法

1.2.1 免疫熒光染色樣品的制備:切取組織塊，網(wǎng)搓法制備單細(xì)胞懸液。取1×106/ml細(xì)胞懸液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后懸浮于染色液(PBS+0.1%tritonX－100+10%山羊血清)中30 min，用來增加細(xì)胞膜的通透性以及封閉非特異性抗體結(jié)合部位。間接免疫熒光法標(biāo)記，加入染色液1∶50稀釋的兔抗人PTEN抗體(美國Epitomics公司)和鼠抗人MMP-2抗體(北京中山公司)各 40 μl，37℃孵育60 min。PBS 洗滌，分別加入染色液1∶50稀釋的間接免疫熒光標(biāo)記物熒光素異硫氰酸鹽(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)IT)標(biāo)記的二抗40 μl，避光室溫孵育30 min，PBS洗滌，除去未結(jié)合的熒光抗體，將細(xì)胞重新懸浮于1 ml PBS中，過濾后上機(jī)檢測。每次檢測以同一患者正常肺組織作為正常對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測方法:采用美國BD公司生產(chǎn)的FACS420型流式細(xì)胞儀，激發(fā)光源為2 W氬離子激光器，輸出功率300 mW，激發(fā)波長為488 nm，進(jìn)行單參數(shù)檢測。所測數(shù)據(jù)、圖形輸入HP-300Consort30計算機(jī)，應(yīng)用相應(yīng)軟件處理，測量前以雞紅細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)品調(diào)校儀器的CV值在5%以內(nèi)。

1.2.3 PTEN和MMP-2表達(dá)的定量分析:以熒光指數(shù)(FI)表示它們的相對含量，公式:FI=(樣品基因蛋白表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度－陰性對照的平均熒光強(qiáng)度)/陰性對照的平均熒光強(qiáng)度。FI＞1.0為PTEN陽性表達(dá)，F(xiàn)I≤1.0 為陰性表達(dá)。

1.3 隨訪 通過電話調(diào)查、信件隨訪及入戶調(diào)查的方式了解73例肺癌患者從手術(shù)之日起2年內(nèi)是否存活、存活時間及其死亡原因。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，采用t檢驗或F檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC與癌旁正常肺組織中PTEN、MMP-2蛋白表達(dá)比較 在肺癌組織中PTEN蛋白表達(dá)，低于癌旁正常肺組織(P＜0.05)。MMP-2蛋白表達(dá)量，高于癌旁正常肺組織(P＜0.05)。見表1。

表1 2組PTEN與MMP-2蛋白表達(dá)比較n=73，±s

表1 2組PTEN與MMP-2蛋白表達(dá)比較n=73，±s

組別 PTEN t值 P值 MMP-2 t值 P值肺癌組1.85 ±0.14 4.568 0.045 1.15 ±0.28 9.168 0.012對照組1.30 ±0.17 1.56 ±0.57

2.2 PTEN、MMP-2蛋白表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系 PTEN、MMP-2蛋白表達(dá)與患者的性別、年齡、吸煙史、腫瘤瘤體大小、病理分型均無關(guān)(P＞0.05)。在TNM分期中，Ⅰ+Ⅱ期肺癌組織中PTEN蛋白表達(dá)高于Ⅲa+Ⅲb期(P＜0.05);肺癌高分化者PTEN蛋白表達(dá)量高于低分化者(P＜0.05)，術(shù)后生存期＜2年者PTEN蛋白表達(dá)量低于≥2年者(P＜0.05);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者PTEN蛋白表達(dá)量低于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P＜0.05)。MMP-2蛋白的表達(dá)量隨著TNM分期增加而增加(P＜0.05)，分化程度越低表達(dá)量越高(P＜0.05)，術(shù)后生存期＜2年者M(jìn)MP-2蛋白表達(dá)量高于生存期≥2年者(P＜0.05);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者M(jìn)MP-2蛋白表達(dá)量高于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P＜0.05)。見表2。

表2 肺癌組織中PTEN和MMP-2蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

PTEN是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個具有雙重特異性磷脂酶活性的抑癌基因，PTEN蛋白能負(fù)向調(diào)控包括AKT及ERK信號通路在內(nèi)的多種細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞正常的生長、發(fā)育及抑制腫瘤細(xì)胞增殖、粘附和轉(zhuǎn)移。PTEN是近年來人們發(fā)現(xiàn)的新抑癌基因，在多種腫瘤如結(jié)直腸癌、黑色素瘤、甲狀腺癌、乳腺癌中表達(dá)減少或缺失［1－4］。本研究結(jié)果顯示，PTEN在肺癌中的表達(dá)量顯著低于癌旁正常肺組織。隨著TNM分期的增加，PTEN的表達(dá)量降低，分期越晚，表達(dá)量越低;隨著肺癌的分化程度越差，PTEN的表達(dá)量就越低;PTEN的表達(dá)量水平隨著肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)展而呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢，并且PTEN表達(dá)量低者生存期短，說明PTEN參與了肺癌的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移過程。

腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的重要條件是細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的降解，MMP-2在降解基底膜過程中起著重要作用［5］，有研究表明在許多腫瘤組織如胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌中，MMP-2過表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［6－8］。本研究結(jié)果顯示，MMP-2在肺癌組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁正常肺組織。MMP-2的表達(dá)量與TNM分期有關(guān)，分期越晚，表達(dá)量越高;隨著肺癌分化程度的降低，MMP-2的表達(dá)量越高;MMP-2的表達(dá)水平隨著肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢，并且MMP-2高表達(dá)者生存期短，說明MMP-2的高表達(dá)與肺癌的不良預(yù)后有關(guān)。

Tian等［9］研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌中，過表達(dá)的PTEN可抑制肝細(xì)胞中MMP-2的表達(dá)，PTEN可通過PI3K/AKT/MMP-依賴的方式來抑制肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，PTEN在肺癌組織中表達(dá)量減弱或缺失，MMP-2的表達(dá)量增加，造成了MMP-2蛋白過剩，從而促進(jìn)了肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與PTEN對MMP-2的抑制作用減弱有關(guān)。

總之，對PTEN及MMP-2表達(dá)的檢測可作為評估肺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的指標(biāo)，PTEN作為一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，有望成為治療肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的新靶點。

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