正交試驗(yàn)優(yōu)選超聲提取蘆筍總皂苷的工藝

揭 晶，王 皓，蔡由生

(武漢生物工程學(xué)院 制藥工程系，湖北 武漢 430415)

蘆筍(Asparagusofficinalis)，又名石刁柏，系百合科天門冬屬多年生宿根性草本植物，是世界十大名菜之一，質(zhì)地鮮嫩，風(fēng)味獨(dú)特、柔嫩爽口，在國(guó)際上享有“蔬菜之王”的美稱[1-3]?，F(xiàn)代研究表明其主要成分為甾體皂苷類，具有較強(qiáng)的生理和藥理活性，包括抗腫瘤、降血脂、抗衰老、抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)等作用[4-7]。

蘆筍總皂苷的提取，目前較為常用的方法是浸提法[8-9]，該法提取時(shí)間長(zhǎng)、操作繁瑣。超聲提取技術(shù)作為一種中藥提取的新技術(shù)，具有省時(shí)、高效、能耗低等優(yōu)點(diǎn)，其在中藥提取工藝中的應(yīng)用越來(lái)越受到關(guān)注。本研究以提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)選蘆筍總皂苷的最佳提取工藝，旨在為其進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HN22-600C型超聲波清洗機(jī)(上海汗諾儀器有限公司)，HHS4S型電子恒溫不銹鋼水浴鍋(上海光地儀器設(shè)備有限公司)，TU-1810型紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，ZBY-26型商用制冰機(jī)(江蘇白雪電器股份有限公司)，BS124S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2 試藥

蘆筍(市售，購(gòu)于武漢新辰食品有限公司)，經(jīng)本系生藥教研室殷丹老師鑒定為石刁柏，切段干燥，粉碎過(guò)60 目篩，備用。菝葜皂苷元對(duì)照品(由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，批號(hào)：20100710，純度98%)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 蘆筍總皂苷的含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取菝葜皂苷元對(duì)照品5.1 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，備用。

2.1.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定

精密吸取對(duì)照品溶液適量，置于10 mL具塞試管中，水浴揮干溶劑，加高氯酸5 mL，搖勻，65 ℃水浴15 min，取出后于冰水浴中冷卻5 min，隨行空白，在200～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，得最大吸收波長(zhǎng)為311 nm。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取對(duì)照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，置于10 mL具塞試管中，水浴揮干溶劑，加高氯酸5 mL，搖勻，65 ℃水浴15 min，取出后于冰水浴中冷卻5 min，在311 nm處測(cè)定吸收度。以菝葜皂苷元質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)，吸收度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=0.002 2x+0.027 7，r=0.999 1，結(jié)果表明在102～307 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2 蘆筍總皂苷的提取

精密稱取2 g蘆筍粉末，置于250 mL錐形瓶中，加入一定濃度的乙醇適量，在一定的水浴溫度條件下超聲提取。然后將粗提液置于500 mL圓底燒瓶中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，再用甲醇溶解，過(guò)濾，于100 mL容量瓶中定容備用。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 乙醇濃度的影響

精密稱取2 g蘆筍粉末六份，分別加入30 mL 40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇，在50 ℃、600 W、40 kHz條件下超聲提取50 min，提取1次，照2.2項(xiàng)下蒸干定容。然后精密吸取樣品溶液0.1 mL，置于10 mL具塞試管中，照2.1.3項(xiàng)下測(cè)定含量，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，隨著乙醇濃度的提高，總皂苷含量逐漸增加，當(dāng)濃度為70%時(shí)，總皂苷含量最高。繼續(xù)提高乙醇濃度，總皂苷含量反而下降。

圖1 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

2.3.2 料液比的影響

精密稱取2 g蘆筍粉末六份，分別加入料液比為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶15、1∶20(W/V)70%乙醇，在50 ℃、600 W條件下超聲提取50 min，提取一次，照2.2項(xiàng)下蒸干定容。然后精密吸取樣品溶液0.1 mL，置于10 mL具塞試管中，照2.1.3項(xiàng)下測(cè)定含量，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，隨著溶劑量的增加，總皂苷含量逐漸增加，當(dāng)料液比為1∶15時(shí)，總皂苷含量最高，變化趨勢(shì)較為平穩(wěn)。

圖2 料液比對(duì)提取率的影響

2.3.3 超聲時(shí)間的影響

精密稱取2 g蘆筍粉末6份，加入30 mL 70%乙醇，在50 ℃、600 W、40 kHz條件下，分別超聲提取10、20、30、40、50、60 min，提取1次，照2.2項(xiàng)下蒸干定容。然后精密吸取樣品溶液0.1 mL，置于10 mL具塞試管中，照2.1.3項(xiàng)下測(cè)定含量，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，隨著超聲時(shí)間的增加，總皂苷含量逐漸增加，當(dāng)超聲時(shí)間為50 min時(shí)，總皂苷含量最高。繼續(xù)增加超聲時(shí)間，總皂苷含量稍有下降。

2.3.4 超聲溫度的影響

精密稱取2 g蘆筍粉末五份，加入30 mL 70%乙醇，分別控制超聲溫度為40、50、60、70、80 ℃，于600 W、40 kHz條件下，超聲提取50 min，提取1次，照2.2項(xiàng)下蒸干定容。然后精密吸取樣品溶液0.1 mL，置于10 mL具塞試管中，照2.1.3項(xiàng)下測(cè)定含量，結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，當(dāng)超聲溫度為50 ℃時(shí)，總皂苷含量最高。繼續(xù)升高溫度，總皂苷含量下降，可能與高溫破壞皂苷成分有關(guān)。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

圖4 超聲溫度對(duì)提取率的影響

2.4 正交試驗(yàn)考察

以蘆筍總皂苷提取率作為指標(biāo)，考察乙醇濃度(%)、料液比(W/V)、超聲時(shí)間(min)、超聲溫度(℃)的影響，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選蘆筍總皂苷的提取工藝。正交試驗(yàn)因素水平詳見(jiàn)表1，結(jié)果及分析見(jiàn)表2、3。

由表2極差可知，各因素對(duì)蘆筍總皂苷提取率的影響順序?yàn)锳>C>B>D，即乙醇濃度>超聲時(shí)間>料液比>超聲溫度，同時(shí)表3結(jié)果表明，乙醇濃度和超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中乙醇濃度的影響非常顯著。因此蘆筍總皂苷超聲提取的最佳工藝為A1B3C1D1，即乙醇濃度70%，料液比1∶15(W/V)，超聲時(shí)間50 min，超聲溫度40 ℃。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表

續(xù)表2

表3 方差分析表

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

最佳提取條件下，按照“2.2”項(xiàng)下方法，計(jì)算蘆筍總皂苷提取率。進(jìn)行了3次重復(fù)測(cè)定，結(jié)果分別為124.5 mg/g、131.7 mg/g、125.9 mg/g，平均提取率為127.4 mg/g，約等于正交試驗(yàn)中的最高提取率，表明通過(guò)正交試驗(yàn)研究達(dá)到了優(yōu)化目的。

3 討 論

蘆筍中的甾體皂苷類化合物是抗癌的主要成分，其水解產(chǎn)物是菝葜皂苷元[10]，所以選擇菝葜皂苷元作為對(duì)照品。由于菝葜皂苷元沒(méi)有紫外吸收，所以選擇高氯酸作為顯色劑，間接測(cè)定蘆筍總皂苷的含量。

前期實(shí)驗(yàn)中，還考察了超聲頻率和提取次數(shù)對(duì)提取率的影響，結(jié)果表明40 kHz比59 kHz條件下的提取率大，第一次的提取率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于第二次和第三次，占總提取率的80%，所以單因素考察時(shí)，選擇提取頻率40 kHz，提取1次。由于實(shí)驗(yàn)條件所限，超聲功率定額600 W，無(wú)法進(jìn)行超聲功率的考察，此項(xiàng)有待完善。

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