高效親和色譜法測(cè)定牛初乳加鈣咀嚼片中免疫球蛋白IgG的含量

邢俊波，曹 紅，陳玉敏，水彩紅，單婷婷，胡 丹，姜春來,靳守東

(中國(guó)人民解放軍總后勤部衛(wèi)生部藥品儀器檢驗(yàn)所，北京 100071)

免疫球蛋白在人體特異性免疫及抗感染過程中起著重要作用，其抗感染能力與其在血清中的含量有直接關(guān)系。各種免疫球蛋白中IgG含量最高，約占血清總免疫球蛋白的75%～80%。IgG是血清和細(xì)胞外液中含量較高的免疫球蛋白,是再次免疫應(yīng)答產(chǎn)生的主要抗體，能有效地預(yù)防相應(yīng)的感染性疾病[1]。牛初乳加鈣咀嚼片是以牛初乳粉和碳酸鈣等為主要原料制成的保健食品，富含免疫球蛋白IgG、免疫促進(jìn)劑等，從而增強(qiáng)兒童的自身免疫力，減少疾病感染機(jī)會(huì)，因此有必要對(duì)其主要功效成分IgG含量進(jìn)行測(cè)定，提高其質(zhì)量可控性。目前IgG檢測(cè)方法主要有濁度法、免疫擴(kuò)散法、紫外分光光度法和酶聯(lián)免疫法等[2-3]，本文建立了采用高效親和色譜柱測(cè)定牛初乳加鈣咀嚼片中IgG的新方法。所建方法簡(jiǎn)便、快捷，專屬性好，可用于其質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀：島津LC-20AT高效液相色譜儀，SPD-20A紫外檢測(cè)器，LC-solution色譜工作站。甲醇為色譜純，水為重蒸水。免疫球蛋白IgG對(duì)照品(CFAD-I5006，上海安譜科學(xué)儀器有限公司)。牛初乳加鈣咀嚼片(1.2 g/片×60片，批號(hào)為20120805、20120310、20130218，廣東湯臣倍健生物科技股份有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：HI-Trap Protein G HP柱(1 mL)；流動(dòng)相A: pH 6.5,0.05 mol/L磷酸緩沖液，流動(dòng)相B: pH 2.5，0.05 mol/L甘氨酸鹽酸緩沖液；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃。

表1 色譜條件

2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按上述色譜條件進(jìn)樣,得對(duì)照品、供試品及空白圖譜，見圖1，空白無干擾，理論板數(shù)按IgG峰計(jì)算可達(dá)8 000以上，且與相鄰雜質(zhì)峰的分離度均能達(dá)到要求。

2.3 供試品溶液的制備

取本品細(xì)粉約0.2 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，用0.05 mol/L磷酸緩沖液稀釋至刻度，搖勻，取上清液濾過，即得。

2.4 對(duì)照品溶液的制備

取免疫球蛋白IgG對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液。

2.5 陰性對(duì)照液的制備

按處方比例制備缺牛初乳的陰性樣品，按含量測(cè)定方法操作，結(jié)果陰性樣品在與免疫球蛋白IgG對(duì)照品相同保留時(shí)間處，未顯示色譜峰。

2.6 線性關(guān)系的考察

精密吸取免疫球蛋白IgG對(duì)照品溶液(1.878 mg·mL-1)，0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL分別置于5 mL量瓶中，用0.05 mol/L磷酸緩沖液定容，搖勻。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程為：Y=62 994.12X-1 921.87，r=0.999 9，線性范圍為：0.150 2～0.751 2 mg/mL。

2.7 樣品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

將待測(cè)樣品溶液，在室溫下貯存，每間隔一定時(shí)間進(jìn)樣測(cè)定，平均峰面積為210 520，RSD為3.35%。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)的牛初乳加鈣咀嚼片6份，按含量測(cè)定方法平行試驗(yàn)，測(cè)得平均含量為25.69 mg·g-1，RSD為0.76%。

2.9 準(zhǔn)確度試驗(yàn)(加樣回收率試驗(yàn))

稱取已知含量的同一批樣品約0.10 g(6份)，精密稱定，分別精密加入免疫球蛋白IgG對(duì)照品適量，按正文供試品溶液的制備方法操作，測(cè)定含量，并計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)

2.10 樣品測(cè)定

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件，以外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果3批制劑分別為25.69 mg·g-1、25.62 mg·g-1、25.85 mg·g-1。色譜圖見圖1。

A.對(duì)照品 B.樣品 C.陰性 1.免疫球蛋白IgG

3 討 論

高效液相親和色譜兼具親和色譜和高效液相色譜的特點(diǎn)，是一種特異性較好的分離技術(shù)，其將配基鍵合在凝膠柱上，先用磷酸鹽緩沖液平衡柱，當(dāng)進(jìn)樣后，活性免疫球蛋白IgG在磷酸鹽緩沖液中與配基連接并吸附在凝膠柱上，再用甘氨酸-鹽酸鹽緩沖液將其洗脫。一般分析時(shí)間短，效率較高，操作也較簡(jiǎn)便。

高效親和柱介質(zhì)為結(jié)合protein G的瓊脂糖，耐受的pH值范圍窄，并且殘余硅羥基可造成非特異吸附而降低收率，甚至導(dǎo)致失活，因此流動(dòng)相pH值的控制是影響分離的關(guān)鍵因素，通過比較不同pH流動(dòng)相后，確定最適流動(dòng)相為pH6.5的磷酸鹽緩沖液與pH2.5的甘氨酸-鹽酸鹽緩沖液。另外從對(duì)照品圖譜上可看出IgG主峰前有其它雜質(zhì)峰，可能是制備時(shí)含有其他雜蛋白所致，但不影響測(cè)定結(jié)果。

參考文獻(xiàn)：

[1] 高永生，黃維星，時(shí)麗秀.不同年齡組血清中免疫球蛋白IgG、IgA、IgM的含量特點(diǎn)[J].中國(guó)冶金工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志, 2012，29(5): 497-498.

[2] 王淼，薛巧如，姚敏菲，等.測(cè)定靜脈注射人免疫球蛋白IgG含量的三種方法比較[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26 (6): 517-520.

[3] 項(xiàng)新華，尹香君，趙丹慧,等.酶聯(lián)免疫雙抗體夾心法檢測(cè)牛初乳素中免疫球蛋白IgG[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2002，12(2)：137-138.