顧志良教授農(nóng)業(yè)動物分子遺傳學(xué)研究綜述

郁建鋒，邵 芳

（常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

動物的肌肉生長、脂類代謝和脂肪組織的形成都是科學(xué)家備受關(guān)注的重要問題.特別是在農(nóng)業(yè)動物中，肌肉生長發(fā)育和體內(nèi)脂類代謝的調(diào)控在畜牧生產(chǎn)和育種中顯得尤為重要.十多年來，顧志良教授圍繞農(nóng)業(yè)動物的重要經(jīng)濟(jì)性狀候選功能基因的克隆和多態(tài)性、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和分子進(jìn)化等方面開展了研究，下面簡要綜述一下他的相關(guān)研究工作.

1 家禽肌肉發(fā)育和脂類代謝相關(guān)功能基因的研究

1.1 Myostatin基因的研究

肌肉生長抑制素（Myostatin，MSTN）作為骨骼肌生長發(fā)育的負(fù)調(diào)節(jié)因子而倍受關(guān)注，研究MSTN基因的結(jié)構(gòu)和功能對闡明骨骼肌生長發(fā)育的調(diào)控具有重要意義.顧志良教授較早地對雞的MSTN基因開展了研究，用PCR-SSCP和DNA測序的方法發(fā)現(xiàn)了5個位于雞MSTN基因5′和3′側(cè)翼區(qū)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，并對9個不同雞種的該基因單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行分析，并在四個區(qū)段發(fā)現(xiàn)了多態(tài)性.不同雞種群體遺傳學(xué)分析表明，5′調(diào)控區(qū)引物P60/P61擴(kuò)增片段多態(tài)性位點(diǎn)在北京油雞的基因型頻率分布與其他品種有很大的差異；對于引物P93/P94，品種間的基因型頻率差異極顯著（P<0.01），北京油雞和AA雞的EE型頻率低于其他品種，白耳雞和海蘭蛋雞中以EE型為主；3′調(diào)控區(qū)引物P80/P81多態(tài)性位點(diǎn)在9個雞種中都是等位基因C占優(yōu)勢.引物P76/P77，總體上MM型的頻率較低，雜合子MN型的頻率較高[1].在CAU資源家系，發(fā)現(xiàn)12周齡AA型腹脂重顯著高于BB型（P<0.05），AA和AB型腹脂率顯著高于BB型（P<0.05），AA型的胸肌率顯著高于AB型，EF型比EE型的高；CC型的胸肌重顯著高于DD型（P<0.05），CC型的胸肌率顯著高于CD型（P<0.05），極顯著高于DD型（P<0.01）.5′調(diào)控區(qū)是基因表達(dá)的重要部位，存在著很多的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位，而MSTN基因這個區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性的變化可能影響到了某個或某些轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合，從而導(dǎo)致了MSTN基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平發(fā)生變化，進(jìn)而出現(xiàn)生產(chǎn)性能的差異.從實(shí)驗的結(jié)果可以看出雞MSTN基因的這些多態(tài)位點(diǎn)與雞的胸肌重和胸肌率的顯著相關(guān)性.與雞腹脂重及腹脂率的相關(guān)性證明MSTN在脂肪形成與沉積中可能起著重要作用；也有可能是通過體內(nèi)能量代謝或調(diào)節(jié)其他細(xì)胞如肌細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞分泌其他細(xì)胞因子間接影響脂肪在體內(nèi)的代謝與沉積[2].

在江蘇省高校自然科學(xué)研究計劃的支持下，對鵝MSTN基因進(jìn)行了研究.克隆了長約為1.3 kb的鵝MSTN基因的5′調(diào)控區(qū)，分析確定了其啟動子和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-34 bp處存在1個TATA盒，-77 bp處存在1個CAAT盒.還發(fā)現(xiàn)在該片段中包含多個肌肉特異性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn).用Northern blot方法檢測到鵝MSTN基因mRNA只在胸肌和腿肌中表達(dá)，具有組織特異性.同時在鵝的MSTN基因5′調(diào)控區(qū)（啟動子部分）的單核苷酸多態(tài)分析發(fā)現(xiàn)了2個多態(tài)位點(diǎn)，其中一個多態(tài)位點(diǎn)正好位于CF/LEF-1的結(jié)合區(qū)，另一個位于內(nèi)含子1上[3-5].檢測了鵝MSTN基因的單核苷酸多態(tài)性，并對10個不同品種（系）鵝單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行了群體遺傳分析.發(fā)現(xiàn)3對引物的擴(kuò)增片段都具有多態(tài)性[5].不同鵝品種（系）群體遺傳學(xué)分析表明，啟動子區(qū)域引物P3擴(kuò)增片段多態(tài)性位點(diǎn)在各群體中等位基因A的頻率均高于等位基因B，且基因頻率均高于0.77，表現(xiàn)為優(yōu)勢基因；引物P4擴(kuò)增片段多態(tài)性位點(diǎn)在揚(yáng)州鵝、朗德鵝、獅頭鵝群體中等位基因D的頻率均高于等位基因C的頻率，在其余群體中均表現(xiàn)為等位基因C的頻率高于等位基因D的頻率[5].分析了鵝的MSTN基因的單核苷酸多態(tài)性與生產(chǎn)系性能的相關(guān)性[6].

1.2 鴨脂聯(lián)素基因的研究

脂聯(lián)素是一種脂肪細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子，它與胰島素抵抗、動脈粥樣硬化之間的相關(guān)性被許多研究者所關(guān)注.在江蘇省自然科學(xué)基金的支持下，課題組開展了鴨脂聯(lián)素的基因克隆和功能研究.獲得了鴨脂聯(lián)素基因1374 bp全長cDNA序列，編碼245個氨基酸；該基因在進(jìn)化過程中具有一定的保守性.研究表明脂聯(lián)素基因在所測組織中均表達(dá)，且高度表達(dá)于脂肪、肌胃、小腸、心和骨骼肌組織.成功構(gòu)建鴨脂聯(lián)素融合蛋白表達(dá)載體pET41a-duck-adp，重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)，獲得了30 KD的鴨脂聯(lián)素原核表達(dá)蛋白[7].還以8個鴨品種為實(shí)驗材料，檢測鴨脂聯(lián)素基因的單核苷酸多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)有7個單堿基突變.鴨群中表現(xiàn)出AA、AB、AC、BB、BC、CC、DD、DE 8種基因型.8種基因型在品種間分布存在極顯著的差異（P<0.01）.除金定鴨外，其他品種均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài).群體遺傳分析表明金定鴨的純合度最高，高郵鴨最低，其他各群體的純合度較相近；金定鴨為低度多態(tài)，高郵鴨為高度多態(tài)，其他品種為中度多態(tài).不同基因型的腹脂等屠宰性狀進(jìn)行方差分析，昆山麻鴨的AA型皮脂重和皮脂率顯著高于AC；櫻桃谷鴨的BC型皮脂率、腹脂重、腹脂率顯著高于AC、CC型.研究表明脂聯(lián)素基因可能是影響鴨脂肪代謝的主效基因或與控制該性狀的主效基因連鎖[8-9].

1.3 雞瘦素受體基因的研究

OBR在Leptin的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著極其重要的作用，與脂肪沉積和體重有關(guān)，因此可以把OBR基因作為研究脂肪沉積的候選基因.以高脂系（FL）、低脂系（LL）以及北京油雞、白耳雞、石歧雜、隱性白羽雞和海蘭蛋雞等為研究對象，用PCR-SSCP結(jié)合序列測序?qū)BR基因的外顯子9的序列多態(tài)性進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在三種基因型.通過獨(dú)立性檢驗發(fā)現(xiàn)基因型頻率分布與品種有關(guān)，高低脂系間的基因頻率有顯著差異，初步認(rèn)為雞的OBR是影響脂肪沉積性狀的重要候選基因之一[10].進(jìn)一步還在OBR內(nèi)含子8序列中發(fā)現(xiàn)了3種基因型，發(fā)現(xiàn)不同基因型在腹脂重和腹脂率上差異顯著，BB型個體的腹脂重和腹脂率顯著高于AB型，極顯著高于AA型，且AA型個體的肝重顯著低于另外兩種基因型.由此可見，OBR基因核苷酸變異影響了雞腹脂沉積及肝重，因此多態(tài)位點(diǎn)也可以作為雞的脂肪性狀的輔助分子標(biāo)記，在雞的育種實(shí)踐中有著重要意義[11].

1.4 鴨Cav-1，3基因的研究

首次克隆了鴨Cav-1，3基因的全長cDNA序列，分別獲得了2603 bp和1066 bp的全長cDNA.實(shí)時熒光定量PCR證實(shí)鴨Cav-1和Cav-3基因在所檢測的12個組織中均有表達(dá)且心肌中表達(dá)量最高.利用PCR-SSCP方法對金定鴨、巢湖鴨、櫻桃谷鴨和高郵鴨四個品種Cav-1，3基因進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性研究，在Cav-3基因第2外顯子上檢測到5個單堿基突變，其中2個突變在編碼區(qū)，為同義突變，其余3個突變位于3′-UTR區(qū).這使所檢測的4個鴨品種共呈現(xiàn)6種基因型，6種基因型在各個鴨品種中分布差異明顯.在Cav-3基因內(nèi)含子上檢測到1個堿基突變，這使所檢測的4個鴨品種共呈現(xiàn)3種基因型，3種基因型在各個鴨品種中分布差異明顯[12].

2 畜禽miRNA的克隆及功能研究

miRNA是一類長度約為22個核苷酸的非編碼小RNA，miRNA主要作用于靶基因mRNA的3′-UTR區(qū)，抑制目標(biāo)mRNA的翻譯或者引起目標(biāo)mRNA降解，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，其廣泛地參與了生物的發(fā)育、分化、細(xì)胞凋亡、腫瘤的發(fā)生等各種生理代謝途徑[13].我們對農(nóng)業(yè)動物的重要生產(chǎn)性狀相關(guān)miRNA的表達(dá)、作用靶點(diǎn)和調(diào)節(jié)機(jī)制作了相關(guān)的研究.

2.1 牛脂肪和乳腺組織miRNA的識別和特征

在國外博士后研究期間，構(gòu)建了牛的脂肪和乳腺這兩個組織的小RNA的cDNA文庫.在牛的脂肪組織小RNA文庫獲得了154個序列，在乳腺的小RNA文庫中獲得了104個序列.miRNA數(shù)據(jù)庫的比對分析表明在脂肪質(zhì)和乳腺組織分別有133個和96個miRNA.這229個牛miRNA進(jìn)一步聚類為54個唯一的miRNA，23個來自脂肪組織，39個來自乳腺組織.鑒定了牛的59個miRNA，其中5個全新的miRNA.采用核酸酶保護(hù)試驗分析了部分miRNA在牛組織的表達(dá)情況，結(jié)果顯示miRNA-21、miRNA-23a、miRNA-24、miRNA-143在乳腺中的表達(dá)明顯高于其他組織，推斷它們在乳腺組織的發(fā)育和生理方面具有重要作用.與其他物種有所不同的是miRNA-133除了在骨骼肌和心肌中表達(dá)以外，在瘤胃中也有表達(dá)，說明miRNA-133在反芻動物所特有的瘤胃的生長發(fā)育和生理方面存在調(diào)控作用[14].這是國際上對牛的miRNA研究的最早報道之一.

2.2 雞的miRNA的研究

在國家自然科學(xué)基金的支持下，從2008年開始我們開展了雞的脂肪、肌肉組織中小RNA的篩選、表達(dá)和功能研究工作.構(gòu)建了AA雞脂肪和肌肉兩個組織小RNA文庫，從雞的脂肪和骨骼肌鑒定了47個miR?NA，其中包括4個與其他物種具有同源性而在雞中未發(fā)現(xiàn)的，還有5個潛在新miRNA，這為弄清雞的脂肪形成、沉積和肌肉的生長等有關(guān)基因轉(zhuǎn)錄后的miRNA調(diào)控機(jī)制奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ).利用生物信息學(xué)方法預(yù)測了兩個組織中所克隆的miRNA在脂肪和肌肉組織中的靶基因，發(fā)現(xiàn)一些基因可能會受到不至一個miRNA的作用.相反有些基因被同一個miRNA調(diào)控.采用TaqMan MicroRNA技術(shù)在雞的12個不同組織、不同日齡分析了 miRNA-23a、miRNA-22、miRNA-133a、miRNA-122、miRNA-199、miRNA-1a、miRNA-126、miRNA-200b、miRNA-145和miRNA-191的表達(dá)情況[15].

后續(xù)開展了miR-133a、miR-126、miR-33、miR-122等miRNAs在雞的肌肉發(fā)育與脂類代謝方面的功能研究.其中運(yùn)用雙熒光素酶和種子區(qū)突變實(shí)驗證明miR-133a能靶定與細(xì)胞增殖有關(guān)的基因BIRC5，為研究miR-133a調(diào)控雞骨骼肌的形成和發(fā)育的機(jī)制既提供了重要的數(shù)據(jù)又奠定了基礎(chǔ).還驗證CNPB為miR-1a的靶基因，揭示了雞miR-1a在肌肉中的重要作用[16].驗證了Spred1是miR-126靶基因.在miR-126的組織表達(dá)分析中發(fā)現(xiàn)其在肺中的表達(dá)量明顯高于其他組織，miR-126在從0至7周肝臟組織中表達(dá)量呈不斷升高的趨勢，推斷miR-126在雞的肝臟的發(fā)育階段中比早期形成階段發(fā)揮著更重要的作用.在離體的雞肝細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)miR-126的表達(dá)量快速下降，2天之后降至2.7%，這可能與肝細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中去分化重新進(jìn)入細(xì)胞周期循環(huán)有關(guān)，暗示miR-126可以負(fù)調(diào)控Spred1而活化Ras-MAPK信號通路，從而促進(jìn)細(xì)胞的生長、分化[17].同樣運(yùn)用生物信息手段發(fā)現(xiàn)，miR-33是定位于SREBP基因內(nèi)含子的miRNA，能負(fù)向調(diào)控FTO基因表達(dá).雞原代肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染LNA-anti-miR-33后，miR-33的表達(dá)量下降，而miR-33的預(yù)測靶基因FTO的表達(dá)量有一定程度的上升，進(jìn)一步證明FTO基因為miR-33的靶基因[18].此外，還發(fā)現(xiàn)miR-33能調(diào)控跟肝臟脂肪酸的氧化相關(guān)的酶基因CROT、HADHB基因的表達(dá)，參與調(diào)控雞肝臟中脂肪酸的合成和氧化，進(jìn)一步影響脂肪組織的沉積[19].

3 動物生長激素(GH)調(diào)節(jié)功能的機(jī)理研究

動物生長是一個復(fù)雜的生物代謝過程，受基因型、激素、營養(yǎng)和環(huán)境等多方面的影響.生長軸是動物體內(nèi)從下丘腦-垂體-靶器官的一系列激素及其受體所組成的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng).生長激素（GH）通過IGF-I介導(dǎo)調(diào)節(jié)動物生長和細(xì)胞分化，通過提高生長軸中GH和IGF-I水平，促進(jìn)增重、提高飼料轉(zhuǎn)化率和改善肉品質(zhì)，是畜禽生長調(diào)控的一種新途徑[20-22].在國家自然科學(xué)基金項目的支持下，開展了GH調(diào)控雞IGF-I基因分子機(jī)制的研究.

GH誘導(dǎo)JAK2-STAT5通路相關(guān)基因表達(dá)的研究主要集中在哺乳動物上.研究了GH對原代雞肝細(xì)胞中表達(dá)并參與GH/IGF-Ⅰ信號通路的相關(guān)基因表達(dá)的影響.發(fā)現(xiàn)GH處理6 h后IGF-I的表達(dá)極顯著的高于對照組（P<0.01）；這種表達(dá)差異水平的現(xiàn)象持續(xù)至18 h；而24 h時其相對表達(dá)量有所下降，但仍顯著高于對照組（P<0.05）.肝臟富含因子（HNF-1α、HNF-1β、HNF-3β）在雞肝細(xì)胞中都有很高的表達(dá)，但是GH處理后，其表達(dá)量與實(shí)驗組相比都無顯著性變化（P>0.05）.這些結(jié)果說明GH調(diào)控IGF-I基因的表達(dá)不通過HNF因子間接介導(dǎo)，這與哺乳動物存在明顯不同[23].GH可以通過STAT5b的介導(dǎo)促進(jìn)哺乳動物IGF-I基因的表達(dá).研究雞IGF-I基因及其上下游側(cè)翼序列上起增強(qiáng)子作用的STAT5b結(jié)合位點(diǎn)，試圖弄清GH調(diào)控雞的IGF-I基因表達(dá)的分子機(jī)理.利用VISTA程序?qū)﹄uIGF-I基因（NW_001471513）及其上下游側(cè)翼端的STAT5b結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析.發(fā)現(xiàn)了在雞IGF-I基因約50 kb和其5′側(cè)翼序列約40 kb以及其3′側(cè)翼序列約10 kb共約100 kb序列上共含有57個STAT5b結(jié)合位點(diǎn)（TTCNNNGAA），按其順序被命名為S1～n；與人類相應(yīng)序列對比，在其保守區(qū)域共有兩個STAT5b結(jié)合位點(diǎn)（S26和S31），其保守性大于70%.首先通過基因重組技術(shù)將57個STAT5b結(jié)合位點(diǎn)分別克隆到熒光素酶報告基因載體上；然后通過體外細(xì)胞培養(yǎng)體系和雙熒光素酶報告基因檢測試驗，找出能夠介導(dǎo)GH促進(jìn)報告基因表達(dá)的位點(diǎn)，進(jìn)一步研究IGF-I基因及其側(cè)翼端序列上57個STAT5b結(jié)合位點(diǎn)中起增強(qiáng)子作用的位點(diǎn).除保守位點(diǎn)S26外，還有S15、S19、S36和S53結(jié)合位點(diǎn)能夠介導(dǎo)GH促進(jìn)報告基因熒光素酶表達(dá)量的增加；在GH刺激下能夠促進(jìn)報告基因熒光素酶表達(dá)量極顯著增加（P<0.01），而且位點(diǎn)突變以后，熒光素酶表達(dá)量顯著降低，基本恢復(fù)本底水平.通過EMSA證明了其中幾個位點(diǎn)確實(shí)能跟含有STAT5b的核蛋白發(fā)生結(jié)合[24].

4 農(nóng)業(yè)動物遺傳多樣性和分子進(jìn)化的研究

近年來，顧志良教授除了前面提到的對家禽功能基因的單核苷酸多態(tài)性在不同品種中的檢測和群體遺傳多樣性研究外，還對豬不同品種的線粒體多樣性和家豬起源、牦牛線粒體全基因組序列分析和反芻動物進(jìn)化及禽類myostain基因的進(jìn)化等開展了研究.

在博士后期間，通過對我國60多個地方豬種和部分引進(jìn)品種的線粒體D-Loop區(qū)和CytB基因序列的分析，初步確定了我國不同地方豬種之間的進(jìn)化關(guān)系[25].測定了牦牛的線粒體基因組全序列，發(fā)現(xiàn)牦牛的線粒體基因組在基因組織結(jié)構(gòu)上與牛相同，發(fā)現(xiàn)D-loop區(qū)的保守區(qū)的保守性反而低于其周圍區(qū)域，采用22個tRNA串聯(lián)基因序列與12SrRNA和16SrRNA基因序列，分別構(gòu)建反芻動物的進(jìn)化樹，根據(jù)線粒體的12SrRNA和16SrRNA基因牦牛和其他反芻動物的分類關(guān)系進(jìn)行了分析，估計了牦牛與普通牛/瘤牛，牦牛和水牛的分化分別發(fā)生在4.38到5.32，10.54到13.85百萬年前.這一結(jié)果與古生物學(xué)的證據(jù)一致[26].

通過克隆的鴨、鵝、鵪鶉、家鴿等幾種禽類的MSTN基因，并結(jié)合GenBank中的其他物種的序列，用禽類的MSTN的氨基酸序列構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)生樹，發(fā)現(xiàn)已知的物種間MSTN基因之間非常保守，暗示著它們的結(jié)構(gòu)和功能非常保守[4].系統(tǒng)發(fā)生樹將MSTN基因分成哺乳動物、鳥類和魚類.在每個群體中平均非同義距離dN和同義距離dS，三個群體的平均dN明顯比平均dS小，非常有趣的是平均dS在哺乳動物和鳥類兩組相似，而平均dN在鳥類顯著小于哺乳類，這暗示著鳥類的選擇約束強(qiáng)于哺乳類，鳥類的MSTN基因的功能非常保守，我們知道不同的氨基酸有不同的生物學(xué)功能，檢測這些位點(diǎn)的進(jìn)化壓力，與成對比較結(jié)果相一致[4].

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