供精精液凍存時(shí)間對人工受精結(jié)局及子代出生缺陷的影響

鄭煒煒 宋 革 鐘小英 張清健 祝曉麗 譚玉梅 姜榮華

廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所，廣東省計(jì)劃生育專科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（廣州，510060）

供精人工授精（AID）是通過非性交方式將供者精液置于女性生殖道內(nèi)，以期精子與卵母細(xì)胞自然結(jié)合，達(dá)到妊娠目的而采取的一種輔助生殖技術(shù)。隨著精子冷凍技術(shù)的日益成熟，人類精子庫的相繼成立，AID技術(shù)得以廣泛應(yīng)用。該項(xiàng)技術(shù)在給人們帶來福音的同時(shí)也帶來了挑戰(zhàn)，其安全性值得關(guān)注。本研究通過對2007年4月～2013年4月在本中心實(shí)施AID助孕者的臨床資料進(jìn)行總結(jié)分析，探討冷凍精液凍存時(shí)間對AID結(jié)局及子代安全性的影響。

1 資料與方法

1.1 對象與分組

2007年4月～2013年4月在廣東省計(jì)劃生育?？漆t(yī)院實(shí)施AID助孕的6038對夫婦共14290個(gè)AID周期的臨床資料。女方年齡20～45（29.59±4.06）歲，不孕年限1～22（4.96±3.14）年。全部病例符合國家衛(wèi)生計(jì)生委關(guān)于輔助生殖技術(shù)規(guī)范的要求，具備AID適應(yīng)證，排除禁忌證后實(shí)施AID治療。按供精精液凍存時(shí)間分為0.5～1年，＞1～3年，＞3～5年，＞5～7年和＞7～10年5組。

1.2 精液來源和質(zhì)量控制

精液來源于廣東省計(jì)劃生育?？漆t(yī)院人類精子庫和浙江省計(jì)劃生育研究所人類精子庫。精液冷凍儲存時(shí)間為0.5～10年，選擇宮頸內(nèi)人工授精（ICI）術(shù)式時(shí)前向運(yùn)動精子總數(shù)≥20×106，選擇宮腔內(nèi)人工授精（IUI）術(shù)式時(shí)前向運(yùn)動精子總數(shù)≥10×106。若精液處理后不達(dá)標(biāo)則需重新追加供精標(biāo)本。

1.3 卵泡監(jiān)測和AID手術(shù)時(shí)機(jī)

采用陰道超聲診斷儀（Aloka－SSD1400）連續(xù)監(jiān)測卵泡發(fā)育和子宮內(nèi)膜情況，結(jié)合尿黃體生成素（LH）、宮頸黏液，以及性激素測定等方法確定排卵時(shí)間，選擇授精時(shí)機(jī)。月經(jīng)規(guī)則，排卵正常者行自然周期人工授精；卵泡發(fā)育不良、排卵障礙或多個(gè)自然周期助孕失敗者使用個(gè)體化的方案誘導(dǎo)排卵，藥物包括氯米芬、他莫昔芬、來曲唑、人絕經(jīng)期促性腺激素、卵泡刺激素和人絨毛膜促性腺激素（hCG）。

1.4 人工授精及隨訪

當(dāng)優(yōu)勢卵泡直徑＞18mm，子宮內(nèi)膜厚度≥7 mm，尿LH 峰出現(xiàn)，或注射hCG 6500～10 000U后24～36h行首次人工授精，超聲確認(rèn)排卵后再次行人工授精。每個(gè)周期常規(guī)授精2次，個(gè)別病例在排卵前或排卵后行單次授精，或圍排卵期授精3次。AID術(shù)后常規(guī)給予黃體功能支持。術(shù)后第10個(gè)月追蹤新生兒情況，包括分娩孕周、分娩方式、新生兒體重、性別和健康狀況等。

1.5 AID治療成功的診斷標(biāo)準(zhǔn)

AID術(shù)后第14～16天若無月經(jīng)來潮（注射hCG者需停藥超過7d），血 －h(huán)CG＞5U／L或尿hCG檢測（＋）為生化妊娠，術(shù)后第30～35天超聲檢查發(fā)現(xiàn)孕囊為臨床妊娠，確定妊娠位置、孕囊數(shù)和活胎數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS18.0軟件包對資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料采用方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 供精精液凍存時(shí)間與AID結(jié)局及子代出生缺陷的關(guān)系

不同精液凍存時(shí)間組前向運(yùn)動精子總數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），各組臨床妊娠率、流產(chǎn)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；2794例臨床妊娠中共發(fā)生子代出生缺陷33例（包括胎兒畸形引產(chǎn)8例），出生缺陷率為1.33%，各組出生缺陷發(fā)生率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表1。

表1 供精精液凍存時(shí)間與AID結(jié)局及子代出生缺陷發(fā)生率的關(guān)系

2.2 子代出生缺陷發(fā)生情況

將33例出生缺陷進(jìn)行分類，結(jié)果顯示先天性心臟畸形比例最高（10／33），其次是唇腭裂（7／33）和先天性腦積水（3／33）等，其他畸形包括先天性膽道閉鎖、肛門閉鎖、多指畸形等15種。33例出生缺陷中8例在妊娠28周前實(shí)施引產(chǎn)術(shù)，引產(chǎn)兒均具有醫(yī)學(xué)指征，分別為重度唇腭裂1例、胎兒肺囊腺瘤1例、胎兒淋巴水囊瘤1例、唐氏綜合征2例、胎兒心臟畸形3例。已出生的25例出生缺陷患兒中有2例合并2處出生缺陷，分別為先天性心臟病合并腦積水和先天性心臟病合并膽道閉鎖，均于出生后2d內(nèi)死亡；2例腦積水患兒出生后死亡；1例先天性膽道閉鎖患兒出生后6個(gè)月死亡，其余出生缺陷兒均存活。33例出生缺陷均發(fā)生于不同編號的供精精液，出生缺陷多發(fā)生在供精精液凍存時(shí)間為0.5～3年，不同精液冷凍時(shí)間組出生缺陷發(fā)生率并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表2。

表2 ADI助孕子代出生缺陷類型在不同精液凍存時(shí)間組的分布（例）

3 討論

精液冷凍是輔助生育中的重要技術(shù)之一，精液冷凍技術(shù)結(jié)合人工授精所進(jìn)行的AID為無精子癥以及先天性遺傳疾病不育患者帶來福音。然而，凍融后的精液質(zhì)量以及凍存時(shí)間的長短是否會對AID結(jié)局和子代的健康造成影響仍令人擔(dān)憂。在精子凍存過程中，各種因素不僅可以破壞精子的物質(zhì)結(jié)構(gòu)，而且還影響精子的功能。因此評估精液冷凍后的受精能力及子代安全性十分必要。

精子冷凍實(shí)際上是精子脫水，同時(shí)冷凍保護(hù)劑滲入精子內(nèi)取代水分的過程。目前的研究認(rèn)為冷凍過程中冰晶形成是造成精子結(jié)構(gòu)受損和喪失活動力的關(guān)鍵。冰晶形成將細(xì)胞局限在一個(gè)狹窄空間內(nèi)，造成精子膜受損、精子微結(jié)構(gòu)變化、精子DNA斷裂、精子線粒體功能及結(jié)構(gòu)受損，而這些變化不僅影響到精子活動力，同時(shí)也影響到精子受精能力及精子遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性，嚴(yán)重者可能導(dǎo)致精子DNA鏈斷裂，影響受精能力或?qū)е略缙谌焉锪鳟a(chǎn)［1］。國內(nèi)外均無關(guān)于精液冷凍儲存時(shí)間的管理?xiàng)l例，冷凍精液儲存時(shí)間長短對受精能力的影響也少有報(bào)道。Clarke等［2］采用精子頂體反應(yīng)和透明帶結(jié)合試驗(yàn)對在液氮中儲存28年的精子進(jìn)行功能測試，證明長時(shí)間的儲存并未損傷精子功能。Yogev等［3］也證明精子液氮冷凍儲存0.5～14.4年，并不改變其前向運(yùn)動總數(shù)，而前向運(yùn)動精子總數(shù)被認(rèn)為是評估AID妊娠率的最重要參數(shù)［4］。本研究中采用的精子凍存時(shí)間為0.5～10年，比較各時(shí)間段前向運(yùn)動精子總數(shù)及臨床妊娠率，認(rèn)為凍存時(shí)間的長短并不影響其受精能力，與上述報(bào)道一致，且臨床妊娠率為19.55%，與普通人群自然受孕率類似。普通人群自然流產(chǎn)約占全部妊娠的10%～15%，且多數(shù)為早期流產(chǎn)（＜12孕周）［5］。文獻(xiàn)報(bào)道AID助孕后流產(chǎn)率為 6.79% ～ 17.70%［6－7］，本 研 究 流 產(chǎn) 率 為12.88%，且多為早期流產(chǎn)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。在本研究中觀察到隨著凍存時(shí)間延長，其流產(chǎn)率有下降趨勢（P＞0.05），分析其原因可能是長時(shí)間凍存精液的AID周期較少所致，如精液凍存時(shí)間在＞7～10年共計(jì)22周期，妊娠6例，無流產(chǎn)發(fā)生。

目前我國出生缺陷發(fā)生率為5.6%，每年新增出生缺陷90萬例。我國出生缺陷監(jiān)測（監(jiān)測期為滿28孕周至出生后7d）數(shù)據(jù)表明，2000～2011年先天性心臟病、多指（趾）、唇裂伴或不伴腭裂、神經(jīng)管缺陷、先天性腦積水等是我國圍產(chǎn)兒前10位高發(fā)畸形［8］。國外一項(xiàng)關(guān)于AID助孕后妊娠11 535個(gè)周期的研究顯示，自然流產(chǎn)率為17.7%，出生缺陷發(fā)生率1.7%（包括新生兒和引產(chǎn)的胎兒）［7］。Hoy等［9］報(bào)道澳大利亞1552例AID助孕后出生缺陷發(fā)生率3.6%。本研究中出生缺陷發(fā)生率為1.33%，出生缺陷的種類主要為先天性心臟病、唇腭裂和先天性腦積水等，與國內(nèi)外的研究報(bào)道一致。本研究出生缺陷發(fā)生主要集中在精液凍存時(shí)間為0.5～3年，與該時(shí)間段AID周期數(shù)多，妊娠例數(shù)多有關(guān)。精液凍存＞5～10年總共妊娠25例，出生缺陷發(fā)生率為0，符合AID出生缺陷率發(fā)生概率。出生缺陷的發(fā)生受多種因素的影響，如夫婦雙方職業(yè)，不良生活習(xí)慣，孕婦孕期的飲食、用藥，環(huán)境因素等。對出生缺陷病例進(jìn)行詳細(xì)的隨訪和分析發(fā)現(xiàn)，33例出生缺陷均發(fā)生于不同編號的供精精液，這些精液用于其他婦女AID，并未發(fā)生出生缺陷，孕期也無特殊狀況發(fā)生。

本研究顯示冷凍精液用于AID安全有效，凍存時(shí)間的長短并不影響AID的妊娠率、流產(chǎn)率和子代出生缺陷率。由于本研究中長時(shí)間儲存精液樣本量較少，最長凍存時(shí)間僅為10年，并且對輔助生殖技術(shù)安全性的評估需要長期臨床觀察和追蹤隨訪。因此，本研究存在一定的局限性，期待著更大樣本量，更長時(shí)間的前瞻性研究對該問題進(jìn)行深入細(xì)致地探討。

［1］ Thomson LK，F(xiàn)leming SD，Aitken RJ，et al.Cryopreservation－induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis［J］.Hum Reprod，2009，24（9）：2061－2070.

［2］ Clarke GN，Liu DY，Baker HWG.Recovery of human sperm motility and ability to interact with the human zona pellucida after more than 28years of storage in liquid nitrogen［J］.Fertil Steril，2006，86（3）：721－722.

［3］ Yogev L，Kleiman SE，Shabtai E ，et al.Long－term cryostorage of sperm in a human sperm bank does not damage progressive motility concentration［J］.Hum Reprod，2010，25（5）：1097－1103.

［4］ Freour T，Jean M，Mirallia S，et al.Predictive value of CASA parameters in IUI with frozen donor sperm［J］.Int J Androl，2009，32（5）：498－504.

［5］ 豐有吉，沈鏗.婦產(chǎn)科學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：64－67.

［6］ 王海燕，喬杰，劉平，等.供精人工授精與供精體外受精胚胎移植的臨床結(jié)局［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2007，15（3）：87－89.

［7］ Thepot F，Mayaux MJ，Czyglick F，et al.Incidence of birth defects after artificial insemination with frozen donor spermatozoa：a collaborative study of the French CECOS Federation on 11535pregnancies［J］.Hum Reprod，1996，11（10）：2319－2323.

［8］ 中華人民共和國衛(wèi)生部.中國出生缺陷防治報(bào)告（2012）［R／OL］.［2012－09－12］.http：／／www.gov.cn／gzdt／2012－09／12／content＿2223371.htm.

［9］ Hoy J，Venn A，Halliday J，et al.Perinatal and obstetric outcomes of donor insemination using cryopreserved semen in Victoria Australia［J］.Hum Reprod，1999，14（7）：1760－1764.