腺苷和蟲草素在北蟲草子實(shí)體各部位中的分布及含量

顏玉文許登泉趙宇蕾王 林鞠婧婧李 雯葛曉群* 陳順志

（1 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系藥理教研室，江蘇 揚(yáng)州 225001；2 江蘇學(xué)府生物工程有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212000）

腺苷和蟲草素在北蟲草子實(shí)體各部位中的分布及含量

顏玉文1許登泉2趙宇蕾1王 林2鞠婧婧1李 雯2葛曉群1* 陳順志2

（1 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系藥理教研室，江蘇 揚(yáng)州 225001；2 江蘇學(xué)府生物工程有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212000）

目的 研究腺苷和蟲草素在北蟲草子實(shí)體各部位中的分布和總含量。方法 用RP-HPLC法分別測(cè)定北蟲草子實(shí)體頭部、中部、底部及全部子實(shí)體中腺苷和蟲草素含量。結(jié)果 ①1號(hào)樣腺苷和蟲草素的含量順序?yàn)轭^部＞底部＞中部；總量順序?yàn)橹胁浚绢^部＞底部。2號(hào)樣腺苷分布規(guī)律沒有明顯變化，但各部位蟲草素含量均有所改變，順序?yàn)榈撞浚局胁浚绢^部，總量順序仍為中部＞頭部＞底部。②兩種樣品的腺苷總含量沒有明顯差異，但2號(hào)樣蟲草素含量幾乎是1號(hào)樣的2倍。結(jié)論 北蟲草子實(shí)體各部位中腺苷和蟲草素的分布以及總含量均有明顯不同。

北蟲草子實(shí)體；HPLC；腺苷；蟲草素

北蟲草又名蛹蟲草[ Cordyceps militaris（L.）Link]，為麥角菌科蟲草屬的模式種，具有抗菌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等功能[1]。它與冬蟲夏草同屬不同種，研究發(fā)現(xiàn)北蟲草和冬蟲夏草的活性成分相似，其中腺苷和蟲草素的含量比冬蟲夏草還要高[2,3]。鑒于野生冬蟲夏草資源短缺，價(jià)格昂貴，因此，開發(fā)利用北蟲草具有廣闊的市場(chǎng)和發(fā)展前景。目前，人工培育北蟲草技術(shù)已很成熟，其培育方法有3種：一是將北蟲草菌接種在蛹體上，長出子實(shí)體。二是將北蟲草菌接種在大米、玉米、小麥等固體培養(yǎng)基上，長出子實(shí)體。三是液體培養(yǎng)北蟲草菌絲體[4]。人工培育的北蟲草子實(shí)體和菌絲體已成為醫(yī)藥和保健品開發(fā)利用的主要原料。

北蟲草含有多種生理活性物質(zhì)，其中核苷類物質(zhì)如腺苷、蟲草素等是研究較多的活性成分。腺苷具有很好的生理和藥理作用[5]。據(jù)報(bào)道，美國已將蟲草素作為抗癌、抗病毒新藥進(jìn)入臨床試驗(yàn)，我國由蟲草素合成的治療白血病新藥也已進(jìn)入Ⅰ期臨床階段[6]，蟲草素作為新藥用于臨床已為期不遠(yuǎn)。由于蟲草素的合成存在一些問題[6]，因此，從北蟲草子實(shí)體或菌絲體中提取蟲草素將成為藥物原料的重要來源之一。為此，我們有必要對(duì)北蟲草子實(shí)體中活性成分的分布和含量有比較清楚的了解，以便更好地開發(fā)和利用它們。本實(shí)驗(yàn)擬選擇腺苷和蟲草素為活性成分指標(biāo)，以大米培養(yǎng)基培育的北蟲草子實(shí)體為樣本，來考察兩種成分在子實(shí)體不同部位的分布和含量。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；KQ-400KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；臺(tái)式離心機(jī)（Eppendorf，Centrifuge，Germany）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；電子天平（Sartorius，Germany）；中藥粉碎機(jī)SZJ-8100（青島索優(yōu)電器有限公司）65目標(biāo)準(zhǔn)樣篩（上海分樣篩廠）；冰箱（BCD-208F，Haier）。

1.2 樣品和試劑

北蟲草子實(shí)體1號(hào)樣、2號(hào)樣和培養(yǎng)基由江蘇學(xué)府生物工程有限公司提供。腺苷標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品鑒定所，批號(hào)：110879-200202，蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品由江蘇學(xué)府生物工程有限公司贈(zèng)送。色譜試劑均為色譜純，甲醇購自TEDIA，USA。

2 方 法

2.1 色譜條件

色譜柱ZOXBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 mm）；二極管陣列檢測(cè)器（DAD檢測(cè)器），柱溫30 ℃；流動(dòng)相：水-甲醇（85∶15），流速1 mL/min，檢測(cè)波長260 nm，進(jìn)樣量20 μL。

2.2 蟲草標(biāo)準(zhǔn)品的確認(rèn)

蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過紫外和核磁共振分析，并通過省級(jí)成果鑒定，其標(biāo)準(zhǔn)品的含量達(dá)到98 %以上（蘇科鑒字[2005]第529號(hào)），進(jìn)一步純化后，經(jīng)中國醫(yī)科院藥物鑒定所分析，其純度達(dá)到99.65 %，并獲得科技部創(chuàng)新基金項(xiàng)目支持，達(dá)到量產(chǎn)水平（項(xiàng)目編號(hào)06C26213201077），該產(chǎn)品已供應(yīng)到中國藥品生物制品檢定所。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別配制濃度為0.5 mg/mL腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)液，等量混合，得標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.6 mL、3.2 mL和4.8 mL，以純凈水稀釋定容至10 mL（濃度范圍為2.5～120 μg/mL），過0.45 μm膜，進(jìn)樣。記錄峰面積，分別以濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。

2.4 樣品溶液制備及測(cè)定

分別取北蟲草子實(shí)體1號(hào)樣、2號(hào)樣頭部、中部、底部、全草和培養(yǎng)基粉。取樣方法為頂端膨大的孢子頭為頭部，靠近培養(yǎng)基的部分為根部，其余中間部分為中部，分別稱重，計(jì)算各部分重量百分比。將樣品在80 ℃烘2h，然后粉碎，過65目篩。取樣0.06 g，精密稱定，分別加水2 mL，48 ℃超聲60 min，5000 r/min離心30 min，留上清，在沉淀中加水2 mL，同上超聲，如此重復(fù)3次，合并3次提取的上清，過膜，進(jìn)樣。每種樣品做3份平行樣。記錄峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算樣品中腺苷和蟲草素的濃度。樣品含量（mg/g）=樣品濃度×稀釋倍數(shù)/樣品重量。樣品某部位活性成分總量（ %）=部位總量/全草總量×100 %

2.5 加樣回收率

準(zhǔn)確稱取已知腺苷或蟲草素含量的北蟲草子實(shí)體0.2 g，分別加入腺苷或蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品低、中、高三個(gè)劑量，每個(gè)劑量做3份平行樣。然后按“2.4”項(xiàng)下制備供試品溶液的方法制備所需溶液，進(jìn)行HPLC法分析，分別計(jì)算腺苷加樣回收率以及蟲草素加樣回收率。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)色譜條件參照文獻(xiàn)[7]略加改進(jìn)。我們?cè)鴮?duì)水-甲醇流動(dòng)相的比例進(jìn)行了考察，結(jié)果測(cè)得在水：甲醇=85∶15及90∶10兩種比例下，分離效果并無大的差別，考慮到對(duì)儀器和系統(tǒng)的保護(hù)，選取水-甲醇（85∶15）為流動(dòng)相。

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在本色譜條件下，測(cè)得腺苷的保留時(shí)間為6.9 min；蟲草素為8.9 min（圖1）。在2.5～120 μg/mL濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈線性關(guān)系，計(jì)算得腺苷回歸方程：y=30962x+1.4829（R2 =0.9998）；蟲草素回歸方程：Y=63637X+68.271（R2=0.9996）。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品（A）與樣品（B）的HPLC色譜圖（1：腺苷；2：蟲草素）

3.2 樣品提取方法的考察

劉小莉等[7]研究發(fā)現(xiàn)以純水作為提取劑，60 ℃超聲50 min時(shí)提取效率最高，重復(fù)3次可完全提取?？紤]到本實(shí)驗(yàn)所用的北蟲草是以大米作為培養(yǎng)基的，培養(yǎng)基粉在溫度超過50 ℃時(shí)容易變稠，故選擇48 ℃超聲。通過對(duì)超聲時(shí)間（50 min、60 min、70 min）的考察，發(fā)現(xiàn)超聲60 min時(shí)提取效率最好。

3.3 加樣回收率

3.3.1 腺苷加樣回收率

分別加入樣品中腺苷含量一半的80 %、100 %和120 %低、中、高3個(gè)加入量，結(jié)果見表1。3個(gè)腺苷加樣量的平均加樣回收率（n＝3）分別為98.0 %（RSD＝0.66 %）、102.5 %（RSD＝1.9 %）、99.9 %（RSD＝1.3 %），平均加樣回收率（n＝9）為100.1 %（RSD＝2.3 %）。

3.3.2 蟲草素加樣回收率

分別加入樣品中蟲草素含量一半的80 %、100 %和120 %低、中、高3個(gè)加入量，結(jié)果見表2。3個(gè)蟲草素加樣量的平均加樣回收率（n＝3）分別為100.8 %（RSD＝0.9 %）、98.3 %（RSD＝0.3 %）、101.1 %（RSD＝1.5 %），平均加樣回收率（n＝9）為100.0 %（RSD＝1.6 %）。

3.4 腺苷和蟲草素在北蟲草子實(shí)體中的分布

分別測(cè)定1號(hào)樣、2號(hào)樣頭部、中部和底部腺苷和蟲草素的量，計(jì)算每克樣品的含量和每個(gè)部位的總量占全草總量的百分比，由此考察含量分布和總量分布，結(jié)果見表3。從表中可知，1號(hào)樣頭部腺苷和蟲草素的含量均高于中部和底部，含量順序?yàn)轭^部＞底部＞中部。然而，由于中部在全草中所占的重量比最大，因此中部腺苷和蟲草素總量最多，總量順序?yàn)橹胁浚绢^部＞底部。2號(hào)樣頭、中、底部腺苷的含量和總量分布規(guī)律與1號(hào)樣的相似；但蟲草素的分布發(fā)生了很大變化，各部位含量均升高，底部升高最多，為頭部的2倍多，含量順序變?yōu)榈撞浚局胁浚绢^部。但各部位蟲草素總量與儲(chǔ)存一年的趨勢(shì)仍然是一致的，即總量順序仍然為中部＞頭部＞底部。

表1 北蟲草子實(shí)體中腺苷的加樣回收率

表2 北蟲草子實(shí)體中蟲草素的回收率

表3 北蟲草子實(shí)體中腺苷和蟲草素的分布比較（n=3）

張倩等[8]報(bào)道人工培育北蟲草在不同生長時(shí)期各部分蟲草素含量順序是在不斷變化的，即上部的含量隨培養(yǎng)時(shí)間延長而增加，下部的含量則在下降，60 d時(shí)含量高低順序是上部、中部、下部。而腺苷含量培養(yǎng)初期上部最高，下部最低，60 d時(shí)，各部位間沒有差異了。因此采收時(shí)期不同，可能分布不同。另外，與該文報(bào)道的相比，我們?nèi)〉牡撞勘壤苄?，中部很大，因此取樣方法不同也可能有影響?/p>

3.5 北蟲草子實(shí)體中腺苷和蟲草素的總含量

測(cè)定全草中腺苷和蟲草素的總含量。結(jié)果顯示兩種樣品中腺苷含量雖有差異，但無顯著性（表4）。蟲草素含量差異較大，2號(hào)樣幾乎是1號(hào)樣的2倍，差異有極顯著性（P＜0.001）（表4）。這兩種樣品從外觀上看，1號(hào)樣呈橘色，頭部膨大數(shù)量較多，中部呈細(xì)柱狀，底部微白；2號(hào)樣呈褐色，頭部膨大數(shù)量較少，中部呈粗扁狀，底部略黑。顯然是不同品種的北蟲草。其活性成分的含量差異可能與菌種來源、培養(yǎng)方法[9]、培養(yǎng)條件[9]、生長時(shí)間[8]、保存時(shí)間[10]等有關(guān)。

表4 北蟲草子實(shí)體中腺苷和蟲草素總含量（n=3）

3.6 北蟲草培養(yǎng)基中腺苷和蟲草素的含量

本實(shí)驗(yàn)還對(duì)培養(yǎng)基中腺苷和蟲草素含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果為腺苷(6.242±0.129) mg/g，蟲草素(1.238±0.042) mg/g，表明培養(yǎng)基中含有腺苷和蟲草素。我們?cè)缭?995年就從培養(yǎng)基中提取蟲草素獲得成功，并通過省級(jí)成品鑒定[11,12]。從培養(yǎng)基中提取蟲草素將是北蟲草開發(fā)利用的重要途徑之一。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明北蟲草子實(shí)體不同部位的腺苷和蟲草素的分布是不同的；不同品種或不同來源的北蟲草子實(shí)體中上述成分的總含量亦存在差異。上述結(jié)果對(duì)開發(fā)利用北蟲草子實(shí)體具有重要的指導(dǎo)意義。

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The Distribution and Contents of Adenosine and Cordycepin in Cordyceps militaris(L.)

YAN Yu-wen1, XU Deng-quan2, ZHAO Yu-lei1, WANG Lin2, JU Jing-jing1, LI Wen2, GE Xiao-qun1, CHEN Shun-zhi2
(1 Department of Pharmacology, Department of Pharmacy of Yangzhou University Medical College, Yangzhou 225001, China; 2 Jiangsu Xuefu Biological Engineering Co. Ltd, Zhenjiang 212000, China)

Objective To investigate the distribution and contents of adenosine and cordycepin in Cordyceps militaris(L.). Methods Using RP-HPLC to determine the contents of adenosine and cordycepin in the head, the middle, the bottom and the whole plant of Cordyceps militaris(L.). Results ①For sample 1, the contents of adenosine and cordycepin were the highest in the head of Cordyceps militaris, and were the lowest in the middle of it, respectively. But it was in the middle that the total amounts of adenosine and cordycepin were the highest, respectively. For sample 2, there was no obvious change in the distribution law of adenosine, but the contents of cordycepin in three parts had changed. The content of cordycepin was the highest in the bottom of Cordyceps militaris, and was the lowest in the head of it, respectively. But as to the total amounts, it was still the highest in the middle. ②There was no significantly difference between the contents of adenosine in two samples , but the content of cordycepin in sample 2 was twice higher than sample 1. Conclusion There were significantly differences on the distribution and total contents of cordycepin and adenosine.

Cordyceps militaris(L.); High performance liquid chromatography(HPLC); Adenosine; Cordycepin

R927.2

：B

：1671-8194（2014）02-0042-03

*通訊作者：E-mail:xqge@163.com