耐甲氧西林金黃色葡萄球菌同源性分析及耐藥性研究

陸軍++++++祝進(jìn)++++++徐禮鋒++++++白永鳳++++++余旭良

[摘要] 目的 對(duì)臨床分離的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）進(jìn)行耐藥情況和分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，探討院內(nèi)MRSA的流行趨勢(shì)。方法 收集我院2009年1月～2011年6月臨床標(biāo)本分離的MRSA菌株60株；采用 Microscan WalkAway 40進(jìn)行菌株鑒定，同時(shí)對(duì)所有金黃色葡萄球菌進(jìn)行藥物敏感性分析；采用脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌進(jìn)行分子分型。結(jié)果 共收集60株MRSA菌株，其中17株被認(rèn)為是可疑社區(qū)獲得（CA-MRSA），43株被認(rèn)為是醫(yī)院獲得（HA-MRSA）。所有菌株均對(duì)萬(wàn)古霉素、替考拉寧、利奈唑胺、呋喃妥因和奎奴普丁/達(dá)福普汀敏感，未出現(xiàn)耐藥菌株。CA-MRSA與HA-MRSA對(duì)左旋氧氟沙星和利福平的敏感性有明顯差異。臨床分離的MRSA菌株P(guān)FGE分型較為分散，共分為13種型別，每種型別的菌株數(shù)分別為2～6株不等，未出現(xiàn)大范圍的院內(nèi)流行克隆。結(jié)論 本院收集的臨床分離的MRSA菌株多重耐藥性嚴(yán)重，其中CA-MRSA相對(duì)HA-MRSA敏感性稍高。所有金黃色葡萄球菌未出現(xiàn)糖肽類(lèi)抗菌藥物耐藥。MRSA菌株未出現(xiàn)大范圍的院內(nèi)流行株，但仍應(yīng)加強(qiáng)院內(nèi)感染流行控制。

[關(guān)鍵詞] 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；社區(qū)獲得性；醫(yī)院獲得性；藥物敏感性；脈沖場(chǎng)凝膠電泳

[中圖分類(lèi)號(hào)] R378.1+1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）07-0084-04

自20世紀(jì)60年代英國(guó)檢出世界上首例耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA），隨后各國(guó)MRSA發(fā)生率逐漸上升，至80年代后期MRSA已成為醫(yī)院院內(nèi)感染的重要病原菌，占醫(yī)院分離的金黃色葡萄球菌的80%以上[1，2]。MRSA常對(duì)多種抗菌藥物呈現(xiàn)耐藥，并可通過(guò)接觸途徑進(jìn)行傳播，從而引起傳播流行，故世界各國(guó)均將MRSA的流行情況作為長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)的重點(diǎn)[3，4]。我院于2009年底開(kāi)始出現(xiàn)MRSA克隆株的流行，為了解MRSA分子流行克隆的耐藥性，探討本院耐甲氧西林金黃色葡萄球菌主要流行株及其分布特點(diǎn)，本研究對(duì)臨床非重復(fù)分離的60株MRSA進(jìn)行分子分型，為院內(nèi)感染的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

2009年1月～2011年6月自衢州市人民醫(yī)院分離的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌60株，剔除重復(fù)菌株。所有菌株用濾紙片法-70℃保存。

1.2 試劑與儀器

西門(mén)子德靈公司MicroScan WalkAway-40全自動(dòng)微生物鑒定儀進(jìn)行鑒定，藥敏紙片選用英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品，限制性內(nèi)切酶ApaⅠ購(gòu)自TaKaRa寶生物工程大連有限公司，溶葡萄球菌素、高密度瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖、溶菌酶、蛋白酶K購(gòu)自生工生物（上海） 公司，Marker沙門(mén)菌Braendebrup血清型H9812由杭州邵逸夫醫(yī)院俞云松教授惠贈(zèng)。CHEP-MAPPER 脈沖電泳儀、Universal HoodⅡ型凝膠成像儀均為BIO-RAD 公司產(chǎn)品，DK-8D型電熱恒溫水槽購(gòu)自上海精宏公司，Rotamax 420搖床為T(mén)hermo公司產(chǎn)品。

1.3 分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

將從臨床采集的合格標(biāo)本中分離的可疑菌落行革蘭染色、觸酶試驗(yàn)、血漿凝固酶試驗(yàn)，并用WalkAway-40全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定并檢測(cè)各菌株對(duì)常用抗菌藥物的敏感性，同時(shí)用頭孢西丁紙片擴(kuò)散法及苯唑西林MIC法篩選MRSA菌株。嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行。判斷標(biāo)準(zhǔn)參照CLSI 2010年版；質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923和ATCC29213。

1.4 CA-MRSA的篩選

參照Fridkin等[5]建議依據(jù)臨床資料篩選CA-MRSA，即從門(mén)診或入院48h內(nèi)分離收集的MRSA，且該患者近期無(wú)長(zhǎng)期住院病史。符合上述條件的將被可疑為CA-MRSA臨床株。

1.5 MRSA臨床菌株的PFGE

參照文獻(xiàn)[6]，細(xì)菌的包埋；細(xì)胞壁的裂解；蛋白酶K消化；內(nèi)切酶對(duì)細(xì)菌DNA的消化；加樣及電泳；凝膠成像儀下觀察結(jié)果，拍照。

1.6 PFGE條帶的解釋

通過(guò)目測(cè)判定其帶型之間的關(guān)系，采用Tenover 等[7]提出的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分型。酶切圖譜間有同樣的條帶數(shù)，且相應(yīng)條帶大小相同，可認(rèn)為是同一型別；由于突變、插入、缺失或倒置的遺傳改變導(dǎo)致1～3條條帶有差異，可認(rèn)為是緊密相關(guān)，定為亞型；帶型中4～6條條帶有差異為可能相關(guān)，可認(rèn)為是不同型別；7個(gè)或更多個(gè)條帶有差異，可認(rèn)為在流行病學(xué)上無(wú)相關(guān)性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)CA-MRSA 組與HA-MRSA 組對(duì)抗菌藥物的敏感性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HA-MRSA和CA-MRSA對(duì)抗菌藥物的耐藥率

依據(jù)臨床資料對(duì)60株MRSA進(jìn)行篩選，獲得17株疑似CA-MRSA（28.33%）及43株HA-MRSA（71.67%）。HA-MRSA和CA-MRSA對(duì)抗菌藥物的耐藥率比較詳見(jiàn)表1。

表1 CA-MRSA與HA-MRSA對(duì)抗菌藥物的耐藥率比較（%）

2.2 60株MRSA臨床分離株經(jīng)PFGE分型

成功分型48株，型別共13種，命名從A型～M型（圖3），其中A型3種亞型共6株，B型2種亞型共5株，C型2株，D型2株，E型6株，F(xiàn)型4株，G型2種亞型共6株，H型2株，I型2種亞型共2株，J型5株，K型2株，L型3株，M型3株。這13種型別均有4條或4條以上電泳條帶不同，可認(rèn)為無(wú)同源關(guān)系的散發(fā)克隆。同一型別菌株有不超過(guò)3條電泳條帶差異，可認(rèn)為是同源克隆。部分PFGE結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 MRSA部分臨床菌株P(guān)FGE電泳圖

1～13為MRSA臨床菌株，M為沙門(mén)菌Braendebrup血清型H9812endprint

從成功分型的48株MRSA菌株型別來(lái)看，這批菌株的同源分型較為分散，沒(méi)有典型的院內(nèi)流行克隆株，相對(duì)較多的A型、E型、G型菌株數(shù)也只有6株，其他分型的菌株數(shù)均不超過(guò)6株。HA-MRSA菌株在每種型中均有出現(xiàn)，其中B型和G型的HA-MRSA菌株較多。CA-MRSA分布在7種型當(dāng)中，其中A型出現(xiàn)3株，E型出現(xiàn)5株。

2.3 PFGE不同型別在3年時(shí)間內(nèi)的變化趨勢(shì)

本研究收集MRSA菌株時(shí)間為2009年1月～2011年6月，期間每年分離到的MRSA菌株數(shù)逐年上升， 2009年分離12株，平均月分離菌株僅1株，2010年分離26株，平均月分離菌株達(dá)到2.2株，而2011年上半年就分離到22株，平均月分離菌株達(dá)到3.7株。PFGE的分型結(jié)果顯示，克隆分型數(shù)有逐年增多的趨勢(shì)，2009年出現(xiàn)5種分型，到2010年分型數(shù)就達(dá)到了9種， 2011上半年也已達(dá)到9種，那些新出現(xiàn)的分型應(yīng)引起特別重視。B型和E型兩種分型3年時(shí)間均有出現(xiàn)，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)這種長(zhǎng)期流行克隆的監(jiān)測(cè)工作。見(jiàn)圖2。

圖2 PFGE不同型別在3年時(shí)間內(nèi)的變化趨勢(shì)

3 討論

MRSA已成為醫(yī)院感染的重要病原菌之一[8]，感染多見(jiàn)于有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病、免疫功能低下并使用侵入性操作和廣譜抗生素者[9]。本研究中， HA-MRSA占分離MRSA中的71.67%（43/60），說(shuō)明院內(nèi)感染仍是最主要的MRSA菌株來(lái)源，因此，為控制MRSA的院內(nèi)感染，做好隔離、消毒措施，合理使用抗生素，嚴(yán)格執(zhí)行醫(yī)院感染控制制度是十分必要的[10]。Cepeda等[11]的研究早已證實(shí)，加強(qiáng)隔離等預(yù)防措施可有效切斷MRSA的傳播、降低其感染率。CA-MRSA占所有MRSA菌株的28.33%，高于章銳鋒等報(bào)道的15.3%[12]，低于溫洪偉等報(bào)道的42%[13]，這可能與地域性和患者來(lái)源有關(guān)。從藥敏結(jié)果分析，所有MRSA菌株對(duì)所有β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素高度耐藥，對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、克林霉素類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)等抗菌藥物的耐藥率>50.0%，而對(duì)萬(wàn)古霉素、呋喃妥因、奎奴普汀/達(dá)福普汀、利奈唑胺和替考拉寧完全敏感。所以，萬(wàn)古霉素仍是治療MRSA所致嚴(yán)重全身性感染的首選藥物，奎奴普汀/達(dá)福普汀、利奈唑胺和替考拉寧可作為萬(wàn)古霉素治療效果欠佳時(shí)的備選藥物，而呋喃妥因目前僅用于治療下尿路感染性疾病。另外，我們還發(fā)現(xiàn)，在對(duì)左氧氟沙星和利福平的敏感性上兩組菌株有明顯差異，CA-MRSA的敏感性高于HA-MRSA，這與一些報(bào)道不完全相符，可能與不同地區(qū)存在不同的抗菌藥物的選擇壓力有關(guān)。

為了解感染源頭、傳播途徑以及克隆株中占主導(dǎo)地位的菌株類(lèi)型，對(duì)懷疑MRSA流行株進(jìn)行流行病學(xué)研究是十分必要且是遏制其爆發(fā)流行的關(guān)鍵，為此人們開(kāi)發(fā)了很多種流行病學(xué)監(jiān)測(cè)的手段，目前MRSA分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)的方法主要有脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）、金黃色葡萄球菌A 蛋白基因（spa）分型、葡萄球菌染色體mec耐藥盒（staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec）分型、多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）等[14]。PFGE 是建立在限制性內(nèi)切酶多態(tài)性分析基礎(chǔ)上的分型技術(shù)，具有分辨率高、費(fèi)用相對(duì)較低等特點(diǎn)，常用于短時(shí)間、小范圍的流行病學(xué)調(diào)查[15]。本研究所進(jìn)行MRSA的分子流行病學(xué)調(diào)查范圍局限在醫(yī)院內(nèi)，因此采用PFGE的方法可以清晰明確地反映院內(nèi)菌株的流行克隆特點(diǎn)。PFGE分型電泳條帶相差1～3條，可認(rèn)為是同一克隆型菌株。從PFGE分型的結(jié)果來(lái)看，院內(nèi)分離60株MRSA沒(méi)有出現(xiàn)大規(guī)模的流行克隆，PFGE所分的型別較散，共有A型～M型13種，每種型別菌株數(shù)最多也僅為6株，有4種型別存在2種以上的亞型。HA-MRSA在各種型別上均有分布，沒(méi)有顯著性的差異，CA-MRSA由于菌株數(shù)較少而分布在7種型別，其中A型和E型菌株數(shù)較多，但沒(méi)有明顯集中趨勢(shì)。MRSA菌株的流行在院內(nèi)有逐年增多的趨勢(shì)，在所有分離到的60株MRSA菌株中，2009年分離12株，平均月分離菌株僅1株，2010年分離26株，平均月分離菌株達(dá)到2.2株，而2011年上半年就分離到22株，平均月分離菌株達(dá)到3.7株。PFGE的分型結(jié)果顯示，克隆分型數(shù)也有逐年增多的趨勢(shì)，對(duì)一些長(zhǎng)期出現(xiàn)的同源克隆分型，應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)，采取切實(shí)可行的院感控制工作。

MRSA很有可能通過(guò)醫(yī)護(hù)工作人員的手及鼻腔傳播給患者，或者在使用侵入性醫(yī)療器械時(shí)發(fā)生交叉感染。因此，加強(qiáng)醫(yī)護(hù)人員的感染控制觀念，利用精確、可靠且分辨率強(qiáng)的分型技術(shù)加強(qiáng)MRSA感染監(jiān)控至關(guān)重要。

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