缺血修飾白蛋白檢測方法的分析性能評(píng)價(jià)

蘇漢文，李棟，陳永勤

（1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北武漢430060；2.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢430062）

0 引言

冠心病已成為嚴(yán)重威脅人們健康的疾病.冠心病的病理基礎(chǔ)是冠狀動(dòng)脈內(nèi)不穩(wěn)定斑塊形成血栓，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈急性完全或不完全栓塞，其最常見的發(fā)病機(jī)制是心肌缺血.傳統(tǒng)的檢測指標(biāo)心電圖、心肌血清學(xué)標(biāo)志物以及影像學(xué)技術(shù)作為心肌缺血早期診斷的指標(biāo)，其敏感性偏低［1－2］；另一方面，臨床上早期心肌缺血如果能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)并予以有效干預(yù)，則能在很大程度上避免不可逆的心肌壞死的發(fā)生.因此，尋找一種對(duì)心肌缺血具有很好的敏感性和特異性，在不可逆性心肌壞死發(fā)生之前，能盡早反映心肌缺血的標(biāo)志物，具有十分重要的意義.

缺血修飾白蛋白（ischemia modified albumin，IMA）是近年來研究較多的心肌缺血檢測項(xiàng)目，能在心肌缺血發(fā)生后5～10min迅速升高，并在缺血過程中持續(xù)升高［3］，美國FDA于2003年批準(zhǔn)其用于臨床診斷心肌缺血，目前國內(nèi)外尚未建立統(tǒng)一的健康人群IMA參考區(qū)間和診斷閾值.本研究采用國產(chǎn)試劑盒和全自動(dòng)生化分析儀，用白蛋白－鈷結(jié)合試驗(yàn)（albumin cobalt binding test，ACB test）定量檢測IMA，旨在評(píng)價(jià)IMA檢測方法的分析性能、建立IMA臨床參考區(qū)間，為其臨床應(yīng)用提供指導(dǎo).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑 由OLYMPUS AU5400全自動(dòng)生化分析儀（日本OLYMPUS公司）和缺血修飾白蛋白試劑盒（湖南長沙頤康科技開發(fā)有限公司生產(chǎn)，雙液體試劑：Rl：CoCl2及穩(wěn)定劑等組成；R2：顯色劑DTT和穩(wěn)定劑等組成，批號(hào)：201052741）為主組成IMA檢測系統(tǒng).標(biāo)準(zhǔn)品濃度為61.8U／mL（批號(hào)：20101250）校準(zhǔn)品和質(zhì)控品（批號(hào)：20102251）采用試劑盒內(nèi)配套校準(zhǔn)品和質(zhì)控品，保證檢測系統(tǒng)測定樣品期間每日室內(nèi)質(zhì)控為在控狀態(tài).

1.1.2 研究對(duì)象 研究對(duì)象為2011年3月—2011年9月來武漢大學(xué)人民醫(yī)院健康體檢的人群.隨機(jī)選擇366人，男206人，女160人，平均年齡（49.5±12.6）歲.入選標(biāo)準(zhǔn)：表征健康個(gè)體作為參考個(gè)體，要求參考個(gè)體肝腎功能、血壓、心肺功能正常；排除標(biāo)準(zhǔn)：有下列情況之一的個(gè)體：貧血、胸痛、心律不齊、心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、外周血管疾病、氣管及支氣管炎癥、支氣管擴(kuò)張癥、肺炎等呼吸系統(tǒng)疾病、糖尿病、腫瘤.

1.1.3 血清樣品的采集 按照實(shí)驗(yàn)室靜脈采血的標(biāo)準(zhǔn)操作程序，于清晨采集研究對(duì)象空腹靜脈血5mL，用帶分離膠的促凝管（美國BD公司生產(chǎn)）分裝，15min后3 000r／min離心5min，分離血清，－20℃密封保存，溶血和脂血血清樣品被剔除.

1.2 方法

1.2.1 IMA含量的檢測方法（ACB test） ACB實(shí)驗(yàn)反應(yīng)原理為白蛋白－鈷結(jié)合試驗(yàn)，其原理為正常情況下，HSA的N－末端能夠和氯化鉆溶液中的鈷離子（Co2＋）結(jié)合從而降低氯化鉆溶液中的游離Co2＋濃度，在心肌缺血患者血液中，HAS被修飾轉(zhuǎn)化成IMA，IMA與外源性Co2＋結(jié)合能力大幅下降，通過向血清標(biāo)本中加入一定濃度的氯化鈷溶液，待正常的HSA與Co2＋充分結(jié)合，溶液中游離的Co2＋則和隨后加入的二琉蘇糖醇（DTT）發(fā)生反應(yīng)顯色，游離Co2＋的濃度與顯色強(qiáng)弱成正比，從而間接反應(yīng)血清標(biāo)本中IMA水平，IMA水平與顯色強(qiáng)度呈正相關(guān).通過分光光度法測定吸光度，吸光度值與游離Co2＋濃度成正比，再通過與白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，換算出樣本中IMA的濃度.檢測結(jié)果的單位定義為：每毫升血清中的ALB在510nm波長下結(jié)合1μg的Co2＋為一個(gè)單位.按試劑盒提供的分析參數(shù)在分析儀上進(jìn)行設(shè)置，通過校準(zhǔn)、室內(nèi)質(zhì)控，合格后進(jìn)行檢測.

1.2.2 IMA檢測方法ACB的線性實(shí)驗(yàn) 參考CLSI EP6－P——定量分析方法線性的評(píng)價(jià)推薦指南（1986），將白蛋白濃度為60.48g／L的復(fù)合校準(zhǔn)血清（上海科華生物工程股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：DS0118）進(jìn)行原倍、1∶2、1∶3、1∶4、1∶6、1∶8倍的稀釋，將每份標(biāo)本平行測定2次，測定的IMA值與對(duì)應(yīng)的白蛋白濃度作線性回歸分析.

1.2.3 精密度評(píng)估實(shí)驗(yàn) 參考美國CLSI文件EP5－A——臨床化學(xué)設(shè)備精密性能的評(píng)價(jià)批準(zhǔn)指南（1999）評(píng)價(jià)方案要求進(jìn)行.實(shí)驗(yàn)樣本的準(zhǔn)備：收集表征健康人新鮮混合血清和不同濃度的IMA標(biāo)本，配制成所需濃度樣本：高濃度（85.63U／mL，H）、中濃度（64.25U／mL，M）、低濃度（32.64U／mL，L）的3份，各分裝10套（每例樣本200μL），－20℃冷凍保存至分析.實(shí)驗(yàn)樣本的檢測：在OLYMPUS AU5400全自動(dòng)生化分析儀上，用湖南長沙頤康科技開發(fā)有限公司的IMA檢測試劑盒連續(xù)檢測3種濃度樣本IMA各20次以評(píng)估批內(nèi)不精密度；每天取出L、M、H樣本各1套，早晚各檢測1次，連續(xù)檢測10d，評(píng)估批間不精密度.分別計(jì)算批內(nèi)、批間檢測值的均值（ˉχ）、標(biāo)準(zhǔn)差（s）及精密度（CV）.

1.2.4 白蛋白－鈷結(jié)合實(shí)驗(yàn)抗干擾實(shí)驗(yàn) 參考CLSI EP7－P——臨床化學(xué)干擾試驗(yàn)推薦指南（1986）評(píng)價(jià)方案，采用“配對(duì)差異”的實(shí)驗(yàn)方法.選取一例血清標(biāo)本1 200μL，平均分成2份組成A、B兩組各3份（每份200μL），A組分別加入不同濃度的干擾物：血紅蛋白、膽紅素、甘油三酯各200μL，干擾物濃度為：血紅蛋白160g／L、膽紅素75.2mmo1／L、甘油三酯8.5mmo1／L（通常情況下臨床標(biāo)本可能出現(xiàn)的最高含量）；B組每份各加入200μL蒸餾水.將每組的標(biāo)本各重復(fù)測定10次，用A組的均值減去相應(yīng)B組的均值即可得干擾值.B組濃度±1.96 SD作為判斷有無干擾的閾值.本實(shí)驗(yàn)選取IMA為32.64U／mL和85.63U／mL的兩個(gè)濃度水平進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn).

1.2.5 參考區(qū)間的確立 按照C28－A2——臨床實(shí)驗(yàn)室等機(jī)構(gòu)提供建立、轉(zhuǎn)移和驗(yàn)證參考區(qū)間的方法指南文件的要求選擇參考人群，然后應(yīng)用Olympus AU5400全自動(dòng)生化分析儀，采用ACB實(shí)驗(yàn)測定血清IMA，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析獲取IMA的參考區(qū)間.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 白蛋白－鈷結(jié)合線性試驗(yàn)的相關(guān)性采用曲線擬合（curve estimation），回歸方程用線性回歸分析；計(jì)量資料兩組間均數(shù)比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；各組間均數(shù)的比較用Z檢驗(yàn)，行單因素方差分析（one－way ANOVA），以P＜0.05定義為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 白蛋白－鈷結(jié)合線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ACB測定不同濃度白蛋白結(jié)果呈線性，白蛋白－鈷結(jié)合線性分析方程式為：y＝1.470 6x＋5.260 6，R2＝0.974 8，表明在白蛋白7.56～60.48g／L范圍內(nèi)白蛋白與鈷結(jié)合線性良好，見圖1.

2.2 精密度試驗(yàn)結(jié)果 檢測方法的精密度對(duì)檢測結(jié)果的穩(wěn)定性至關(guān)重要，因此分析方法的性能評(píng)價(jià)必須對(duì)其批內(nèi)和批間精密度進(jìn)行嚴(yán)格的評(píng)價(jià).通常以檢測結(jié)果的變異系數(shù)來反應(yīng)精密度.本文中對(duì)高、中、低3個(gè)IMA濃度血清的IMA進(jìn)行批內(nèi)和批間的檢測結(jié)果分析見表1.由表1可知，高、中、低3個(gè)樣本的IMA含量檢測的批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)分別為3.01%和3.24%、2.63%和4.36%、4.77%和5.59%，均小于廠商說明書聲明的5.06%和6.72%，表明本實(shí)驗(yàn)檢測系統(tǒng)精密度性能符合臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量目標(biāo)管理的要求.

圖1 白蛋白－鈷結(jié)合線性分析

表1 ACB法檢測IMA檢測系統(tǒng)的精密度

2.3 白蛋白－鈷結(jié)合干擾實(shí)驗(yàn) 臨床化學(xué)實(shí)驗(yàn)室常見的干擾來至于檢測樣本，樣本溶血、黃疸以及脂血是最常見的干擾因素.本文中選擇IMA為32.64U／mL和85.63U／mL的低高兩個(gè)濃度水平標(biāo)本來研究其干擾實(shí)驗(yàn)，兩個(gè)濃度樣本的血紅蛋白、膽紅素、甘油三酯干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別為：34.52±2.01U／mL、34.01±1.98U／mL、30.68±2.11U／mL和86.12±2.68U／mL、85.76±2.84U／mL、82.35±2.73 U／mL，均分布在對(duì)照組結(jié)果的95%置信區(qū)間28.89～36.26U／mL和77.73～87.38U／mL內(nèi)，參考CLSI EP7－P評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)表明該方法在本臨床實(shí)驗(yàn)室檢測系統(tǒng)中抗干擾性能良好.

2.4 參考區(qū)間的建立

2.4.1 參考個(gè)體組成情況 排除Alb低于30.0g／L、ALT、Glu、Crea、TG、Chol和ECG異常的體檢者，本實(shí)驗(yàn)最后入選的參考個(gè)體共366例，其中男性206例，女性160例，年齡范圍為15～75歲，平均年齡49.5歲.符合C28－A2文件要求的最低120例標(biāo)準(zhǔn).

2.4.2 離群值的處理 按照C28－A2文件要求，需要對(duì)離群值進(jìn)行處理.觀察所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，存在3個(gè)疑似離群點(diǎn)，參照C28－A2文件，將其與鄰近點(diǎn)的差值D（4.85）與數(shù)據(jù)全距R（16.25）相除，D／R＝0.298＜1／3，故不認(rèn)為該點(diǎn)為離群點(diǎn)，保留所有測定數(shù)據(jù).

2.4.3 不同性別IMA檢測結(jié)果分析 醫(yī)學(xué)參考區(qū)間的建立，通常要考慮人群的性別、年齡、種族等因素.為比較人群中男性和女性IMA結(jié)果，本文將366例檢測結(jié)果按性別分成兩組.經(jīng)Z檢驗(yàn)，同時(shí)作方差分析，結(jié)果見表2.從表2可以看出，Z檢驗(yàn)的z值小于z＊，并且男性與女性的標(biāo)準(zhǔn)差之比小于1.5，即男性和女性檢測結(jié)果的差異無臨床實(shí)際意義；男性和女性的IMA檢測結(jié)果方差齊性，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（P＞0.05）顯示無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.因此本實(shí)驗(yàn)的參考區(qū)間不需要按照性別差異分開計(jì)算.

2.4.4 按年齡分組的IMA檢測結(jié)果分析 因?yàn)槟行院团缘腎MA檢測結(jié)果的差異無臨床意義，現(xiàn)按年齡分組計(jì)算各組的IMA檢測結(jié)果均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并做統(tǒng)計(jì)分析.結(jié)果表明，不同年齡組間的IMA值也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（各組間比較，P＞0.05，見表3），因此在分析IMA的參考區(qū)間時(shí)不需要考慮年齡因素.2.4.5 IMA檢測數(shù)據(jù)的頻數(shù)分布圖 分析366例參考個(gè)體，其中最低的IMA值為60U／mL，最高為85 U／mL.參照C28－A2文件，對(duì)366例檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，繪制IMA檢測數(shù)據(jù)的頻數(shù)分布圖（圖2），顯示參考人群血清IMA值的分布情況.進(jìn)行分布正態(tài)性檢驗(yàn)，偏度系數(shù)為－0.13，峰度系數(shù)為1.388，說明數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布（P＜0.05）.其中頻數(shù)最高的測定值為65.00U／mL.所有數(shù)據(jù)的算術(shù)平均數(shù)為69.885 3U／mL，標(biāo)準(zhǔn)差為5.326 8U／mL.

圖2 缺血修飾白蛋白測定結(jié)果的頻數(shù)分布圖

表2 不同性別間IMA（U／mL）檢測結(jié)果

表3 不同年齡組IMA（U／mL）檢測結(jié)果（s）

表3 不同年齡組IMA（U／mL）檢測結(jié)果（s）

各組間比較，P＞0.05.

分組 年齡區(qū)間／歲 樣本數(shù)n IMA值（ˉχ±s）43 64.83±5.47 105 64.39±6.58 3 46～60 108 69.24±5.90 4 61～70 80 67.24±5.68 5＞70 30 70.86±5.72

2.4.6 確立IMA的參考區(qū)間 采用百分位點(diǎn)法計(jì)算：根據(jù)IMA理論上的臨床意義，IMA的參考區(qū)間只需考慮單邊，參照CA28－A2文件，按統(tǒng)計(jì)學(xué)第5%位點(diǎn)的值為65.20U／mL，因此IMA的健康人群參考區(qū)間為IMA＞65.20U／mL.

3 討論

缺血修飾白蛋白（IMA）作為心肌缺血輔助診斷指標(biāo)，對(duì)心肌缺血靈敏度很高，且在心肌缺血5～10min后即可檢測到，在心肌缺血過程中一直存在，其定量檢測結(jié)果對(duì)早期心肌缺血的診斷具有十分重要的意義，已逐步應(yīng)用于臨床［4－5］.

本研究使用湖南長沙頤康科技開發(fā)有限公司的IMA檢測試劑和OLYPAUS AU5400全自動(dòng)生化分析儀組成檢測系統(tǒng)，按照試劑說明書提供的分析參數(shù)，在生化分析儀上設(shè)置分析參數(shù).為保證國產(chǎn)試劑檢測結(jié)果的質(zhì)量，本研究參照CLSI系列文件，對(duì)該檢測系統(tǒng)進(jìn)行了分析性能評(píng)價(jià)和驗(yàn)證.參照EP6－P文件的要求，進(jìn)行白蛋白與鈷離子結(jié)合線性實(shí)驗(yàn)性能評(píng)價(jià)，結(jié)果表明在白蛋白7.56～60.48g／L范圍內(nèi)，白蛋白與鈷離子結(jié)合具有良好的線性，線性方程為：y＝1.470 6x＋5.260 6，R2＝0.974 8.人群中白蛋白通常在20～60g／L范圍內(nèi)，因此本線性實(shí)驗(yàn)為開展臨床標(biāo)本檢測做好了基礎(chǔ)性準(zhǔn)備.按照CLSI的要求，參照EP5－A文件的要求，對(duì)建立的IMA檢測系統(tǒng)進(jìn)行測量精密度評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示該檢測系統(tǒng)精密度高、中、低值樣本的批內(nèi)CV和批間CV，均低于試劑廠商說明書聲明的5.06%＆6.72%，符合臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量目標(biāo)管理的要求，從而保證檢測結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性.

抗干擾能力的高低是評(píng)價(jià)檢測方法分析性能的重要指標(biāo).為評(píng)價(jià)本檢測方法的抗干擾能力，參考CLSI EP7－P評(píng)價(jià)方案，采用“配對(duì)差異”的實(shí)驗(yàn)方法，評(píng)價(jià)在臨床上可能出現(xiàn)的常見檢測干擾物：血紅蛋白（當(dāng)檢測標(biāo)本準(zhǔn)備過程中出現(xiàn)溶血時(shí)）、膽紅素（病人出現(xiàn)黃疸時(shí)）和甘油三酯（當(dāng)患者出現(xiàn)高脂血癥、或者進(jìn)食高膽固醇、高蛋白飲食后）對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，結(jié)果IMA為32.64U／mL和85.63U／mL的兩個(gè)濃度水平的血紅蛋白、膽紅素、甘油三酯干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果均分布在對(duì)照組結(jié)果的95%置信區(qū)間內(nèi)，表明該方法在本臨床實(shí)驗(yàn)室檢測系統(tǒng)中抗干擾性能良好，能滿足臨床應(yīng)用需求.

鑒于目前暫沒有國人可借用的IMA參考區(qū)間，要求要用戶根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室的檢測系統(tǒng)，建立合適的參考區(qū)間.C28－A2是為臨床實(shí)驗(yàn)室、試劑廠商等機(jī)構(gòu)提供建立、轉(zhuǎn)移和驗(yàn)證參考區(qū)間的方法指南，本研究參照該文件建立本實(shí)驗(yàn)室的參考區(qū)間.本研究納入統(tǒng)計(jì)的樣品366例，男性206例，女性160例，男性和女性的IMA檢測結(jié)果方差齊性，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（P＞0.05）顯示無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這與相關(guān)報(bào)道一致［6－7］.男性和女性檢測結(jié)果的差異無臨床實(shí)際意義，因此本實(shí)驗(yàn)的參考值不需按照性別差異分開計(jì)算.按年齡分組計(jì)算各組的IMA檢測結(jié)果均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并做統(tǒng)計(jì)分析，各年齡段組的IMA無顯著性差異，因此不需要考慮年齡因素.所有結(jié)果IMA正態(tài)性檢驗(yàn)偏度系數(shù)為－0.12，峰度系數(shù)為1.379，表明數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布（P＜0.05）.其中，測定值為65.00U／mL的頻數(shù)最高.根據(jù)IMA的理論臨床意義，確定IMA的健康人群參考區(qū)間為IMA＞65.20U／mL.

本實(shí)驗(yàn)的局限性在于為單中心的研究，參考個(gè)體涵蓋面有限.根據(jù)C28－A2文件的要求，若能進(jìn)行多中心研究，則能獲取更客觀的參考值數(shù)據(jù)，因?yàn)椴煌t(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室合作建立的參考區(qū)間，其樣本量較大，與醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室單獨(dú)建立的參考區(qū)間相比，能減少不同醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室參考區(qū)間之間的離散性［8］，這樣得到的參考區(qū)間更加客觀，對(duì)臨床醫(yī)生的指導(dǎo)意義更大.因此，可在后續(xù)的研究中考慮不同地點(diǎn)、不同采血季節(jié)等因素，盡可能使統(tǒng)計(jì)結(jié)果反映健康群體的真實(shí)狀態(tài).各醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用于臨床之前，應(yīng)按C28－A2文件程序進(jìn)行參考區(qū)間驗(yàn)證，即用20例健康人的血清檢測IMA，不超過2例的IMA檢測值在參考區(qū)間外則驗(yàn)證成功.

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