咸寧地區(qū)部分桂花品種的ISSR分析

范付華，夏輝，王振啟，陳洪國

（1.湖北科技學(xué)院核技術(shù)與化學(xué)生物學(xué)院，湖北咸寧437100；2.咸寧職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北咸寧437000）

0 引言

桂花（Osmanthus fragrans Lour.）為木犀科（Oleaceae）木犀屬（Osmanthus Lour.）植物，是我國特有的常綠小喬木或灌木經(jīng)濟(jì)樹種，原產(chǎn)于我國長江流域至華南、西南各地，在長期的人工栽培和演化過程中，形成了歷史上著名的桂花五大產(chǎn)區(qū)：江蘇蘇州、浙江杭州、湖北咸寧、四川成都和廣西桂林.桂花栽培范圍廣，自然環(huán)境復(fù)雜，由此也產(chǎn)生了許多的性狀變異，形成了豐富的品種資源.長期以來，科研工作者以形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)對(duì)桂花品種進(jìn)行分類，但由于對(duì)品種概念、分類方法及標(biāo)準(zhǔn)的認(rèn)識(shí)不盡相同，20世紀(jì)80年代以后，有多人提出了不同的分類標(biāo)準(zhǔn)［1－4］，導(dǎo)致了部分桂花品種分類較為混亂，記載不統(tǒng)一.咸寧作為“中國桂花之鄉(xiāng)”，從桂花數(shù)量、產(chǎn)量到品種都保持全國領(lǐng)先地位，對(duì)咸寧桂花遺傳多樣性的研究將有助于其品種及其相關(guān)產(chǎn)業(yè)的長遠(yuǎn)發(fā)展.

分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛用于植物遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系和品種鑒定。盡管利用分子標(biāo)記技術(shù)研究桂花親緣關(guān)系、品種分類等已見諸多報(bào)道［5－10］，其中咸寧地區(qū)部分種質(zhì)親緣關(guān)系的分析也有涉及［7，9］，但所選品種較少，不足以反映咸寧桂花品種遺傳多樣性的實(shí)質(zhì).本研究中以咸寧地區(qū)48份桂花主要栽培品種為供試材料，利用ISSR技術(shù)分析鑒定，旨在進(jìn)一步揭示咸寧地區(qū)桂花親緣關(guān)系和品種多樣性，為地方桂花資源保護(hù)和遺傳改良提供更充實(shí)的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料 選取咸寧地區(qū)48份桂花主要栽培品種作為研究對(duì)象。試驗(yàn)材料均采集于湖北咸寧潛山國家森林公園。采集幼嫩葉片，液氮處理后迅速放入－80℃超低溫冰箱保存.試驗(yàn)所用的材料如表1.

表1 供試桂花品種名稱及其資源類別

1.2 DNA的提取及檢測 取超低溫保存下的幼嫩桂花葉片，利用DNA secure Plant Kit（DP320－02）試劑盒（天根）提取DNA.經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量完好后，用TE緩沖液稀釋DNA至約20ng／μL，放入－20℃冰箱備用.

1.3 PCR擴(kuò)增及檢測 參照范付華［11－12］方法，稍作修改.選取UBC公司公布的50條ISSR引物序列.篩選出合適的引物及每個(gè)引物的最佳退火溫度.最適ISSR擴(kuò)增反應(yīng)體系為（15μL）：7.5μL Mix，1.2μL引物（10μmol／L），1.5μL模板DNA和4.8μL ddH2O.PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性4min；94℃變性1min，復(fù)性1min，溫度隨引物而定（表2），72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min.ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析 每個(gè)引物重復(fù)擴(kuò)增2次，選擇可重復(fù)且清晰可見的譜帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì).將擴(kuò)增所得到的譜帶按“引物號(hào)－片段長度”進(jìn)行指紋記錄，以按譜帶的有無分別賦值“1”和“0”建立數(shù)據(jù)庫，利用NTSYSpc 2.10e軟件計(jì)算供試材料間的相似性系數(shù)，并構(gòu)建親緣關(guān)系樹狀圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR擴(kuò)增多態(tài)性 采用篩選出的11條擴(kuò)增穩(wěn)定性高、譜帶清晰的ISSR引物，對(duì)48份供試桂花材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析.結(jié)果表明（表2）：所有11條引物共擴(kuò)增出清晰可辨的譜帶81條，平均每個(gè)引物可擴(kuò)增7.4條，其中多態(tài)性譜帶共70條，多態(tài)性比率達(dá)到86.4%；擴(kuò)增出譜帶最多的引物為825，共10條帶；819擴(kuò)增的譜帶最少，僅為5條；823、842和844擴(kuò)增的譜帶多態(tài)性比率都達(dá)到了100%；引物891獲得多態(tài)性譜帶的比率最低，僅為71.4%.所有引物擴(kuò)增出的DNA片段大小大多在250～2 000bp之間，并且譜帶清晰（圖1），可以用于桂花親緣關(guān)系及遺傳多樣性分析.上述ISSR引物檢測到較高的多態(tài)性譜帶比率，說明了桂花品種間的遺傳變異較大.

表2 用于PCR擴(kuò)增的ISSR引物及其擴(kuò)增結(jié)果

圖1 引物842擴(kuò)增48份供試材料的電泳圖樣品1～48的含義同表1

2.2 遺傳相似系數(shù)分析 供試材料的SIMQUAL相似系數(shù)在0.46～0.97之間.29號(hào)“滿條紅”在湖北咸寧地區(qū)稱作“紅花”，自古享有盛名，是當(dāng)?shù)爻Ｒ姷钠贩N，其與同為丹桂品種群的22號(hào)“大花丹桂”的相似系數(shù)最大，達(dá)到了0.97.相似系數(shù)最小的是來自四季桂品種群的3號(hào)和6號(hào)“小葉四季桂”和“天女散花”與丹桂品種群的24號(hào)“平脈紅”，僅為0.46，說明這兩個(gè)品種間具有較大的遺傳差異，推測親緣關(guān)系較遠(yuǎn).對(duì)各個(gè)品種群內(nèi)樣品之間的遺傳相似系數(shù)分析，四季桂品種群平均值為0.79，丹桂品種群為0.76，銀桂品種群為0.75，金桂品種群為0.74.由此可知，咸寧地區(qū)四季桂品種群內(nèi)種質(zhì)間的遺傳差異相對(duì)較小，遺傳多樣性不如其他品種群，其中金桂品種群遺傳多樣性相對(duì)最為豐富.

2.3 供試桂花品種的聚類 采用UPGMA法對(duì)供試桂花品種進(jìn)行聚類分析，建立樹狀分支圖（圖2）.48份材料在以相似系數(shù)0.75為閾值的情況下被分為5類，第Ⅰ大類包含所有的9個(gè)四季桂品種；第Ⅱ類全部為秋季開花的22個(gè)品種（包括銀桂、丹桂和金桂品種群）；丹桂12個(gè)品種及金桂1個(gè)品種聚為第Ⅲ大類.金桂品種群36號(hào)“大葉黃”與供試材料遺傳距離較遠(yuǎn)，單獨(dú)聚為第Ⅳ類；第Ⅴ大類中包括2個(gè)丹桂品種“平脈紅”、“朱砂丹桂”和1個(gè)金桂品種“叢中笑”.從聚類圖中可見，四季桂品種群與秋桂品種可以明顯分開，而四季桂較之其他品種群童期短、花期長，一年多次開花，說明桂花親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近與其開花習(xí)性具有一定的相關(guān)性.由圖2可知，四季桂品種單獨(dú)被聚為1類，銀桂品種群10個(gè)品種聚為1類，丹桂品種群15個(gè)品種分別聚入不同的3類，而金桂品種群14個(gè)品種被聚入不同的4類.反映了咸寧地區(qū)金桂品種群的遺傳多樣性比其他品種群豐富，這與遺傳相似系數(shù)的結(jié)論一致.

圖2 48個(gè)咸寧桂花品種的UPGMA聚類分析圖

3 討論

從ISSR引物擴(kuò)增譜帶的多態(tài)性比率和供試品種間遺傳相似性系數(shù)可知，咸寧地區(qū)桂花品種間具有較大變異，存在豐富的遺傳多樣性，這與長期的自然選擇和人工干預(yù)密切相關(guān).咸寧也以其資源的多樣性、栽培的廣泛性、桂花產(chǎn)量和品質(zhì)的優(yōu)良性于2000年被國家命名為唯一的“中國桂花之鄉(xiāng)”.桂花各品種群平均遺傳相似性系數(shù)依次為四季桂品種群 ＞ 丹桂品種群 ＞ 銀桂品種群 ＞ 金桂品種群，這與李梅等［8］研究結(jié)果相似又不完全相同，僅在銀桂和金桂品種群間有所區(qū)別.種群間遺傳多樣性比率顯示咸寧地區(qū)桂花大部分種內(nèi)變異存在于秋桂（金桂、銀桂、丹桂）之間.桂花品種資源遺傳多樣性的分析，為當(dāng)?shù)胤N質(zhì)資源管理和育種提供重要參考.

聚類分析結(jié)果（圖2）顯示，多季開花的四季桂品種全部聚在一起，與3個(gè)秋桂類品種群遺傳距離較遠(yuǎn).基于ISSR分子標(biāo)記的聚類結(jié)果與按傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)的一級(jí)分類標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果相符，說明開花習(xí)性是桂花品種劃分的依據(jù)之一，具有重要的分類學(xué)意義.由聚類圖可見，秋桂中各個(gè)品種群的大多數(shù)品種可以先聚在一起，部分不同品種群的品種也會(huì)聚為一個(gè)分支，但多為花色相近的品種，特別是花色為橙紅色的丹桂品種群的品種幾乎聚在1類，而其他品種也是先聚為同一品種群后再與別的品種群有所交集.這與趙小蘭等［13］的同工酶分析、尚富德等［5］的RAPD分析、韓遠(yuǎn)記等［7］的AFLP分析，以及李梅等［8］的ISSR分析的結(jié)論基本相似，說明將桂花花色作為品種分類標(biāo)準(zhǔn)具有一定合理性，但本研究中金桂與銀桂、金桂與丹桂部分品種往往也聚在一起，因此，僅以花色作為桂花品種分類的二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)并不能完全反映品種間的親緣關(guān)系.綜上所述，今后應(yīng)以傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合酶學(xué)、分子標(biāo)記及解剖學(xué)等多種分類方法，相互印證［14］，以期提出更科學(xué)合理的桂花品種分類系統(tǒng).

ISSR是Zietkiewicz等［15］創(chuàng)建起來的以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)且不要求預(yù)知基因組序列信息的分子標(biāo)記，該項(xiàng)技術(shù)兼具RAPD和SSR優(yōu)點(diǎn)，DNA用量少、多態(tài)性水平高、可重復(fù)性好、穩(wěn)定性高，是一種快速、可靠、可提供豐富位點(diǎn)信息的DNA指紋技術(shù)［16］，已在多種果樹［17］、林木［18］上得到廣泛應(yīng)用，在親緣關(guān)系和品種鑒定方面有較高的可靠性.本研究中發(fā)現(xiàn)，ISSR標(biāo)記揭示出桂花不同品種及不同品種群間的多態(tài)性較豐富，存在較明顯的遺傳差異.并非每一個(gè)供試桂花品種都具有特征標(biāo)記，但通過不同的ISSR引物組合，能將所有樣品區(qū)分開，且與蔡宇良等［19］對(duì)櫻桃種質(zhì)資源的分析中認(rèn)為的隨著引物數(shù)量增加而區(qū)分更多材料的結(jié)論一致.對(duì)供試材料相似性系數(shù)及聚類顯示，丹桂品種群中22號(hào)“大花丹桂”和29號(hào)“滿條紅”遺傳差異極小，本研究中可視為同一品種，對(duì)于是否是引物太少導(dǎo)致的此類結(jié)果，將結(jié)合品種的形態(tài)特征，利用更多的分子標(biāo)記方法進(jìn)行深入研究.

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