大孔樹脂法純化刺玫果總皂苷工藝研究

鐘方麗，王曉林，付麗娟，薛健飛

（吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022）

0 前言

刺玫果系薔薇科薔薇屬植物山刺玫（Rosa davurica Pall.）的成熟果實，廣泛分布于我國東北、內(nèi)蒙、山西等省，其營養(yǎng)價值高，是純天然綠色食藥同源、有廣闊開發(fā)前景的野生果類[1-2].皂苷是一類具有降血糖、降血脂、抗病毒、抑制腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用的化學(xué)成分，除用作藥物外，在化妝品和食品工業(yè)也有廣泛的應(yīng)用[3-4].皂苷類化合物是刺玫果的活性成分之一，刺玫果水提物及醇提物均可降低大鼠、兔的血壓及腦血管阻力、增加冠脈流量、抑制血小板聚集、延長凝血時間、抑制血栓形成.臨床測試發(fā)現(xiàn)老年人服用刺玫果浸膏粉后，血流速度明顯加快、血液黏度明顯下降，刺玫果的這些作用與其所含皂苷化合物有關(guān)[5].大孔樹脂為一種有機(jī)高聚吸附劑，具有選擇性吸附有機(jī)化合物的能力，應(yīng)用于皂苷類成分的純化有較好的效果[6-7]，而有關(guān)刺玫果總皂苷純化工藝的研究尚未見報道.因此，筆者選用6 種不同型號的大孔樹脂進(jìn)行了刺玫果總皂苷純化，并對D-101型大孔樹脂純化刺玫果總皂苷的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期為進(jìn)一步開發(fā)和利用刺玫果提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺玫果采自吉林市豐滿區(qū)，經(jīng)吉林化工學(xué)院藥學(xué)系薛健飛博士鑒定為薔薇科薔薇屬植物山刺玫的成熟果實；大孔樹脂（LSA-21、LSA-10、AB-8、LX-36、D-101、LSA-33）：西安藍(lán)曉科技有限公司；齊墩果酸（供含量測定用）：中國藥品生物制品檢定所；無水甲醇、無水乙醇：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；香草醛：沈陽市試劑三廠；冰乙酸：天津市福晨化學(xué)試劑廠；濃硫酸：天津市雙船化學(xué)試劑廠；水為重蒸餾水.

1.2 儀器與設(shè)備

752N 型紫外可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；R-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D 型循環(huán)水真空泵：河南省鞏義市英峪儀器一廠；CS101-AB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱：中國重慶實驗設(shè)備廠；JY2002 型電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司.

1.3 方法

1.3.1 總皂苷含量測定

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精確稱取干燥至恒重的齊墩果酸對照品2.1 mg，置于10 mL 容量瓶中，加無水甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.21 mg/mL 的齊墩果酸對照品溶液[8].分別取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置于10 mL 的具塞試管中，于70 ℃水浴上揮發(fā)除去溶劑；加入5%香草醛-冰醋酸2 mL，70%硫酸溶液5 mL，60 ℃水浴加熱20 min，流水冷卻10 min，搖勻[9-10]，以相應(yīng)的試劑為空白，于544 nm 處測定吸光度A.進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A=0.026 1C-0.063 6（R=0.999 3），其中C 為齊墩果酸濃度，μg/mL.結(jié)果表明吸光度與齊墩果酸濃度在6.0～36.0 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系.

1.3.1.2 樣品含量測定

取樣品液、吸附后液及解吸液各適量，置于10 mL 具塞試管中，照“1.3.1.1”的方法，于544 nm 處測定吸光度，以不加供試品的平行樣為空白.從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中齊墩果酸的量，計算即得供試品中總皂苷的含量.以樹脂吸附率、解吸率為指標(biāo)來考察6 種樹脂對刺玫果總皂苷純化的選擇性.各指標(biāo)的計算公式如下[11]：

吸附率=[（C0-C1）/C0]×100%；

解吸率={V2×C2/[V1×（C0-C1）]}×100%；

純度=（m2/m1）×100%；

式中：C0為起始樣品液的總皂苷濃度，mg/mL；C1為吸附48 h 后溶液的總皂苷濃度，mg/mL；C2為解吸液的總皂苷濃度，mg/mL；V1為樣品液體積，mL；V2為解吸液體積，mL；m1為解吸液干燥后固體的質(zhì)量，mg；m2為解吸液中總皂苷的測定量，mg.

1.3.2 刺玫果總皂苷提取液的制備

稱取粉碎后刺玫果50 g，分別加入8 倍生藥量的80%乙醇，加熱回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，放冷后過濾，濾液減壓蒸餾回收乙醇，濃縮至相對密度為1.31～1.35（60 ℃），蒸餾水定容至250 mL 容量瓶中，搖勻，得刺玫果提取原液，備用.

1.3.3 樹脂的預(yù)處理[12]

取大孔吸附樹脂LX-36，LSA-33，LSA-10，D-101，AB-8，LSA-21 各50 g 加入柱內(nèi)，先以95%乙醇連續(xù)洗滌數(shù)次約2 h，至流出液加水（1∶5）不混濁為止，后用蒸餾水洗至無醇味，然后用5%HCl 浸泡4 h 后以4～6 BV/h 洗滌2 h，再用蒸餾水洗至中性，最后用2%NaOH 溶液浸泡6 h 后以4～6 BV/h洗滌2 h，再用蒸餾水洗至中性，抽濾至干，置于密閉容器中備用.

2 結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)吸附及靜態(tài)解吸考察

取處理后的濕樹脂LX-36、LSA-33、LSA-10、D-101、AB-8、LSA-21 各2 g，加入100 mL 具塞三角瓶中，然后加入40 mL 總皂苷濃度為1.385 mg/mL的刺玫果總皂苷提取液，每10 min 振搖一次約30 s，共2 h；靜置48 h，過濾.分別吸取各樹脂吸附后的藥液0.1 mL，在544 nm 處測量吸光度，計算各樹脂對刺玫果總皂苷的吸附率.將靜態(tài)吸附的樹脂抽濾至干，加入具塞三角瓶中，然后加入95%乙醇100 mL 進(jìn)行解吸，每10 min 振搖一次，每次30 s，持續(xù)2 h，靜置48 h，過濾.分別吸取各解吸液0.5 mL，于544 nm 處測定吸光度，計算各種樹脂對刺玫果總皂苷的解吸率[13].6 種大孔吸附樹脂對刺玫果總皂苷的靜態(tài)吸附及解吸的試驗結(jié)果見表1.

表1 6 種大孔樹脂對刺玫果總皂苷的吸附率與解吸率

由表1 可知，以解吸率為考察指標(biāo)，D-101、LX-36、LSA-10 3 種樹脂的解吸率均高于50%，所以選擇上述3 種樹脂進(jìn)行進(jìn)一步研究.

2.2 動態(tài)吸附及動態(tài)解吸考察

取處理后的濕樹脂LX-36、LSA-10、D-101 各4 g，濕法裝柱，分別加入30 mL 總皂苷濃度為6.714 mg/mL 的刺玫果總皂苷提取液，以2 BV/h的流速進(jìn)行動態(tài)吸附，待充分吸附后，收集吸附后的溶液，于544 nm 處測定吸光度，計算各樹脂對刺玫果總皂苷的吸附率.然后再用50 mL 95%乙醇以2 BV/h 的流速進(jìn)行動態(tài)解吸，分別收集各解吸液，于544 nm 處測定吸光度，計算各種樹脂對刺玫果總皂苷的解吸率.3 種大孔吸附樹脂對刺玫果總皂苷的動態(tài)吸附及解吸的試驗結(jié)果見表2.

表2 3 種樹脂對刺玫果總皂苷的動態(tài)吸附與解吸

由表2 可以看出，以解吸率作為考察指標(biāo)，在所考察的樹脂中，D-101 型大孔吸附樹脂的解吸率和吸附率相對較高，故選擇D-101 型樹脂進(jìn)行進(jìn)一步工藝優(yōu)化研究.

2.3 D-101 型大孔吸附樹脂的吸附工藝優(yōu)化[14]

2.3.1 上樣藥液濃度的考察

取已處理好的D-101 型吸附樹脂5 份，各6 g，濕法裝柱（玻璃樹脂柱直徑為2 cm），分別加入刺玫果提取原液（總皂苷濃度為34.09 mg/mL）以及分別稀釋5、10、15、20 倍的刺玫果總皂苷提取液各30 mL，先以2 BV/h 的流速進(jìn)行吸附，待充分吸附后，分別收集吸附后藥液并記錄體積，于544 nm 處測定吸光度，計算各樹脂對刺玫果總皂苷的吸附率.然后以75%乙醇各50 mL 以2 BV/h 的流速進(jìn)行解吸，分別收集解吸液并記錄體積，于544 nm 處測定吸光度，計算解吸率.總皂苷提取液濃度對刺玫果總皂苷純化效果的影響見表3.

表3 上樣濃度對刺玫果總皂苷純化效果的影響

由表3 可以看出，以解吸率為主要考察指標(biāo)，在其他條件相同時，隨著總皂苷提取液濃度的減小，解吸率先增大后又減小，稀釋10 倍的樣品溶液的解吸率最高，所以總皂苷提取液最佳上樣濃度為原液稀釋10 倍濃度，即用濃度相當(dāng)于原生藥0.02 g/mL 的藥液上柱即可.

2.3.2 吸附速率的考察

取已處理好的D-101 型吸附樹脂5 份，各6 g，濕法裝柱，分別加入刺玫果總皂苷提取液（皂苷濃度為3.409 mg/mL）各25 mL，分別以1、2、3、4、5 BV/h 的流速進(jìn)行吸附，待充分吸附后，分別收集吸附后藥液并記錄體積，于544 nm 處測定吸光度，計算各樹脂對刺玫果總皂苷的吸附率.然后以75%乙醇各50 mL 以2 BV/h 的流速進(jìn)行解吸，分別收集解吸液并記錄體積，于544 nm 處測定吸光度，計算解吸率.吸附速率對刺玫果總皂苷刺玫果總皂苷純化效果的影響見表4.

由表4 可以看出，以解吸率為主要考察指標(biāo)，在其他條件相同時，隨著吸附速率增大，解吸率先增大后減小，最佳吸附速率為3 BV/h.

2.3.3 解吸液濃度的考察

取已處理好的D-101 型吸附樹脂5 份，各6 g，濕法裝柱，分別加入刺玫果總皂苷提取液（皂苷濃度為3.409 mg/mL）各25 mL，以3 BV/h 的流速進(jìn)行吸附，待充分吸附后，收集吸附后藥液并記錄體積，于544 nm 處測定吸光度，計算各樹脂對刺玫果總皂苷的吸附率.然后分別以10%、30%、50%、75%、95%乙醇各40 mL 以2 BV/h 的流速進(jìn)行解吸，分別收集解吸液并記錄體積，于544 nm 處測定吸光度，計算解吸率.解吸液濃度對刺玫果總皂苷純化效果的影響見表5.

表4 吸附速率對刺玫果總皂苷純化效果的影響

表5 解吸液濃度對刺玫果總皂苷純化效果的影響

由表5 可以看出，以解吸率為主要考察指標(biāo)，在其他條件相同時，隨著解吸液乙醇濃度的增大，解吸率不斷增大，最佳解吸液乙醇濃度為95%.

2.3.4 解吸速率的考察

取已處理好的D-101 型吸附樹脂5 份，各6 g，濕法裝柱，分別加入刺玫果總皂苷提取液（皂苷濃度為3.409 mg/mL）各25 mL，以3 BV/h 的流速進(jìn)行吸附，待充分吸附后，收集吸附后藥液并記錄體積，于544 nm 處測定吸光度，計算各樹脂對刺玫果總皂苷的吸附率.然后以95%乙醇各40 mL，分別以1、2、3、4、5 BV/h 的流速進(jìn)行洗脫，分別收集洗脫液并記錄體積，于544 nm 處測定吸光度，計算解吸率.解吸速率對刺玫果總皂苷純化效果的影響見表6.

結(jié)果表明，以解吸率為主要考察指標(biāo)，在其他條件相同時，隨著解吸速率的增大，解吸率先增大后減小，最佳解吸速率為3 BV/h.

2.3.5 洗脫終點考察

取已處理好的D-101 型吸附樹脂6 g，濕法裝柱，加入刺玫果總皂苷提取液（皂苷濃度為3.409 mg/mL）25 mL，以3 BV/h 的流速進(jìn)行吸附，待充分吸附后，收集吸附后液并記錄體積，計算吸附率.然后用95%乙醇以3 BV/h 的流速進(jìn)行解吸，分別按0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、8.0、10.0 個樹脂床體積收集解吸液，于544 nm 處測定吸光度，計算解吸液中總皂苷的含量，結(jié)果見圖1.

表6 解吸速率對刺玫果總皂苷純化效果的影響

圖1 洗脫終點考察結(jié)果

從圖1 可以看出，解吸液中總皂苷濃度隨解吸液用量呈顯著下降趨勢，當(dāng)洗脫液用量大于4 BV時，洗脫液中已檢測不到皂苷，所以當(dāng)洗脫液用量為4 BV 時，可以將總皂苷完全洗脫.

2.3.6 上柱藥液pH 值的考察

取已處理好的D-101 型吸附樹脂7 份，各6 g，濕法裝柱，準(zhǔn)備刺玫果總皂苷提取液（皂苷濃度為3.409 mg/mL）25 mL 7 份，用4%HCl 溶液和3%NaOH 溶 液 分 別 調(diào)pH 至2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5，分別裝入樹脂柱內(nèi)，以3 BV/h 的流速進(jìn)行吸附，待充分吸附后，收集吸附后液并記錄體積，于544 nm 處測定吸光度，計算各樹脂對刺玫果總皂苷的吸附率.然后以95%乙醇各48 mL 以3 BV/h 的流速進(jìn)行解吸，收集解吸液并記錄體積，于544 nm 處測定吸光度，計算解吸率.總皂苷提取液pH 值對刺玫果總皂苷純化效果的影響見表7.

表7 上柱藥液pH 值對刺玫果總皂苷純化效果的影響

由表7 可見，以解吸率為主要考察指標(biāo)，在其他條件相同時，隨著總皂苷提取液pH 值的增大，解吸率逐漸增大，但當(dāng)總皂苷提取液pH 值大于9時，藥液出現(xiàn)渾濁，影響含量測定結(jié)果，所以未考察pH 值大于9 時對純化效果的影響，pH 值在8.5時解吸率最高，故刺玫果總皂苷提取液最佳pH 值確定為8.5.

2.4 D-101 型大孔吸附樹脂純化刺玫果總皂苷工藝驗證

取已處理好的D-101 型吸附樹脂3 份，各6 g，濕法裝柱，分別加入pH 值為8.5 的刺玫果總皂苷提取液（皂苷濃度為3.409 mg/mL）各25 mL，以3 BV/h 的流速進(jìn)行吸附，待充分吸附后，用48 mL 95%乙醇以3 BV/h 的流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，于544 nm 處測定吸光度，計算吸附率和解吸率.再各取50 mL 上柱液、45 mL 洗脫液倒入稱重后的蒸發(fā)皿中水浴蒸干，基本蒸干后放入60 ℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中，待其干燥至恒重后稱重，得浸膏質(zhì)量，計算總皂苷的含量.按優(yōu)化得到的純化工藝進(jìn)行3 次重復(fù)試驗，經(jīng)計算平均吸附率為92.79%，平均解吸率為71.66%，干膏中總皂苷含量平均為40.35%，結(jié)果見表8.

表8 D-101 型大孔吸附樹脂純化刺玫果總皂苷工藝驗證試驗

由表8 可以看出，經(jīng)D-101 大孔吸附樹脂處理刺玫果醇提液后，干膏中總皂苷含量由大約13%提高到40%左右，且具有較好的重現(xiàn)性.

2.5 樹脂的重復(fù)使用

取已處理好的D-101 型吸附樹脂6 g，濕法裝柱，加入pH 值為8.5 的刺玫果總皂苷提取液（皂苷濃度為3.409 mg/mL）25 mL，以3 BV/h 的流速進(jìn)行吸附，待充分吸附后，收集吸附后液并記錄體積.以95%乙醇48 mL 以3 BV/h 的流速進(jìn)行解吸，收集解吸液并記錄體積，于544 nm 處測定吸光度，計算吸附率、解吸率和浸膏中總皂苷的含量，上述操作在同一根柱上重復(fù)操作5 次[15].試驗結(jié)果見表9.

表9 D-101 型大孔吸附樹脂重復(fù)使用試驗

由表9 可見，D-101 型大孔吸附樹脂重復(fù)使用5 次后，干浸膏的含量下降了8.70%，解吸率降低了32.28%，而重復(fù)使用3 次后，干浸膏的含量只下降了1.91%，解吸率降低了21.64%，所以建議使用D-101 型大孔吸附樹脂純化刺玫果總皂苷時，重復(fù)使用次數(shù)為3 次.

2.6 樣品脫脂與未脫脂對比試驗

稱取粉碎后刺玫果50 g，使用石油醚30 mL回流脫脂2 次，每次30 min；除去石油醚后，分別加入8 倍生藥量的80%乙醇，加熱回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，放冷后過濾，取濾液減壓蒸餾回收乙醇，濃縮至相對密度為1.31～1.35（60℃），蒸餾水定容至250 mL 容量瓶中，搖勻，得刺玫果提取原液，標(biāo)號為A，備用.

稱取粉碎后刺玫果5 g，分別加入8 倍生藥量的80%乙醇，加熱回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，放冷后過濾，取濾液減壓蒸餾回收乙醇，濃縮至相對密度為1.31～1.35（60 ℃），蒸餾水定容至250 mL 容量瓶中，搖勻，得刺玫果提取原液，標(biāo)號為B，備用.

稱取粉碎后刺玫果5 g，分別加入8 倍生藥量的80%乙醇85 ℃加熱回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，放冷后過濾，取濾液減壓蒸餾回收乙醇，濃縮至相對密度為1.31～1.35（60 ℃），使用石油醚萃取2 次，每次30 mL；棄除石油醚層，蒸餾水定容至250 mL 容量瓶中，搖勻，得刺玫果提取原液，標(biāo)號為C，備用.

取已處理好的D-101 型吸附樹脂3 份，各6 g，濕法裝柱，分別加入pH 值為8.5 的刺玫果總皂苷提取液A、B、C，按“2.4”項的方法進(jìn)行試驗.結(jié)果表明，刺玫果是否脫脂及脫脂方式對解吸率和總皂苷純度具有一定的影響，在其他條件相同時，未脫脂樣與脫脂樣比較，脫脂樣的解吸率由69.13%提高到78.12%，干浸膏中總皂苷的含量由40.35%提高到45.56%；刺玫果脫脂樣與提取液脫脂樣比較，提取液脫脂樣的解吸率由78.12%提高到82.37%，干浸膏中總皂苷的含量由45.56%提高到52.58%，由此可知將刺玫果加入8 倍生藥量的80%乙醇加熱回流提取后，用石油醚脫脂后，再按“2.4”所述的方法進(jìn)行純化，刺玫果干浸膏中總皂苷的含量可達(dá)到50%以上.

3 結(jié)論

對6 種不同型號的大孔吸附樹脂進(jìn)行了刺玫果總皂苷純化試驗，通過考察影響大孔吸附樹脂吸附及解吸的各種因素，初步確定了D-101 型大孔吸附樹脂分離純化刺玫果總皂苷的效果比較理想，其最佳工藝為：將刺玫果加入8 倍生藥量的80%乙醇加熱回流提取后，制成藥液濃度為0.02 mg/mL（相當(dāng)于原生藥）的上柱液，用石油醚脫脂，調(diào)藥液pH 值為8.5，以3 BV/h 速率進(jìn)行吸附，然后用95%乙醇以3 BV/h 的流速洗脫，干浸膏中總皂苷的含量由原來的13.17%提高到52.58%，樹脂富集倍數(shù)為3.99 倍.試驗表明，D-101 型大孔樹脂對刺玫果總皂苷具有良好的純化性能，為刺玫果總皂苷的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù).

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