加味二術(shù)散對(duì)斷奶仔豬空腸黏膜抗氧化能力和免疫力的影響

葉瑞興,邱 銀,李英倫

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川雅安 625014)

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，應(yīng)激是一種全身的非特異性反應(yīng)，作用頻度大或時(shí)間過長(zhǎng)的應(yīng)激常致使機(jī)體產(chǎn)生全身適應(yīng)綜合征，如機(jī)體內(nèi)環(huán)境失衡，出現(xiàn)行為、生理和生化反應(yīng)的改變[1]。仔豬斷奶后第1周常發(fā)生斷奶應(yīng)激綜合癥，會(huì)導(dǎo)致仔豬腹瀉，死亡率可達(dá)20%～30%，嚴(yán)重制約養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[2]。仔豬斷奶時(shí)其腸道功能和結(jié)構(gòu)尚未發(fā)育成熟，受營(yíng)養(yǎng)、心理和環(huán)境多種應(yīng)激因素的影響，機(jī)體的免疫系統(tǒng)會(huì)被激活，應(yīng)激超出一定范圍可引起機(jī)體炎性細(xì)胞因子過量釋放而導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)的Th1/Th2(Th為輔助性細(xì)胞)失去平衡，最終導(dǎo)致腸道炎癥和機(jī)體免疫功能下降。腸道發(fā)生炎癥時(shí)，炎區(qū)內(nèi)聚集的激活的巨噬細(xì)胞和腸黏膜中的吞噬細(xì)胞耗氧量增加，機(jī)體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，最終加重腸黏膜的損傷[3-4]。因此，有效改善腸黏膜的抗氧化和免疫能力必將對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。小腸是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的主要器官，而空腸是小腸中最長(zhǎng)的腸段。本試驗(yàn)自擬加味二術(shù)散(Two Macrocephala Flavored Powder，TMFP)，觀察其對(duì)斷奶仔豬空腸黏膜抗氧化酶活性和免疫力的影響，以探明加味二術(shù)散對(duì)斷奶仔豬空腸黏膜的修復(fù)作用，為防治斷奶仔豬應(yīng)激綜合癥提供有效方劑。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)藥品 加味二術(shù)散由白術(shù)、蒼術(shù)、丹參、柴胡、陳皮(質(zhì)量比為5∶4∶2∶2∶2)組成，原藥材購(gòu)買自雅安中藥材公司；五味中藥經(jīng)熱風(fēng)循環(huán)干燥箱50 ℃烘干 3 h，超微粉碎，過孔徑0.150 mm(100目)的篩，密封保存。

1.1.2 供試動(dòng)物 30日齡斷奶仔豬(杜×長(zhǎng)×大)45 頭，由四川雅安富強(qiáng)養(yǎng)豬場(chǎng)提供。

1.1.3 試 劑 總超氧化物歧化酶(T-SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)、過氧化氫酶(CAT)活性、丙二醛(MDA)含量測(cè)定試劑盒和考馬斯亮藍(lán)試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物有限公司。IL-2和SIg A試劑盒，均購(gòu)自武漢基因美生物公司。

1.1.4 儀器設(shè)備 721可見分光光度計(jì)，BECKMAN 64R，BIO-RAD microplate reader等。

1.2 方 法

1.2.1 動(dòng)物分組 試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取30日齡(杜×長(zhǎng)×大)斷奶的健康仔豬45頭，隨機(jī)分為 3 個(gè)處理組，即：空白對(duì)照組(飼喂基礎(chǔ)日糧)、中藥組(飼喂基礎(chǔ)日糧中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%加味二術(shù)散的日糧)、抗生素組(飼喂基礎(chǔ)日糧中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%硫酸粘桿菌素的抗生素日糧)。每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5頭斷奶仔豬。將3個(gè)處理仔豬分欄飼養(yǎng)，按基礎(chǔ)飼糧中添加的藥物成分將3組仔豬編號(hào)。

1.2.2 飼養(yǎng)管理 在實(shí)驗(yàn)前將所用仔豬舍徹底消毒。舍內(nèi)保持清潔干燥，通風(fēng)良好。試驗(yàn)期間，仔豬自由飲水和采食，按常規(guī)免疫程序進(jìn)行免疫。

1.2.3 樣品采集及處理 于試驗(yàn)第 7，14和 21天上午10:00，從每個(gè)處理組中隨機(jī)選取 3 頭仔豬放血致死，取出內(nèi)臟，采取空腸中段 25 cm 的腸道，將其用剪刀剖開，用冰的生理鹽水沖洗干凈后，平鋪于準(zhǔn)備好的冰盒上，并用濾紙吸干多余的水分。用滅菌的玻片輕輕刮取腸黏膜，分裝于準(zhǔn)備好的EP管中，立即放入液氮中速凍，之后再轉(zhuǎn)入-80 ℃ 低溫冰箱中凍存。將空腸黏膜組織置于已浸泡在冰水內(nèi)的組織勻漿器內(nèi)，按1 g加9 mL的比例加入冰的生理鹽水進(jìn)行研磨，研磨好的液體分裝到滅菌的5 mL離心管中離心(3 000 r/min，15 min)，取上清液立刻進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 測(cè)定指標(biāo)及方法 總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)、總抗氧化能力(T-AOC)及丙二醛(MDA)、IL-2、SIg A含量的測(cè)定，均嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書操作。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 使用 SPSS 17.0 分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸黏膜抗氧化結(jié)果分析

T-SOD能清除超氧陰離子自由基(O2-)，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。CAT在一定條件下能直接分解其底物過氧化氫(H2O2)。MDA含量的高低間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。斷奶仔豬腸黏膜抗氧化能力的測(cè)定結(jié)果見表1。由表1可知，中藥組仔豬空腸黏膜中T-SOD酶活力在試驗(yàn)第7和14天顯著高于空白組對(duì)照組(P<0.05)；在第7，14和21天顯著高于抗生素組(P<0.05)。在試驗(yàn)的第7天，中藥組仔豬空腸黏膜中CAT活力顯著高于空白對(duì)照組和抗生素組(P<0.05)，而在試驗(yàn)第14 和21天與空白對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。中藥組仔豬空腸黏膜中的MDA含量在試驗(yàn)第14天顯著低于空白對(duì)照組和抗生素組(P<0.05)；在第7和21天與空白對(duì)照組均無顯著差異(P>0.05)；在第7天時(shí)顯著低于抗生素組(P<0.05)。各組仔豬空腸黏膜中的T-AOC在第7天無顯著差異(P>0.05)；在第14天，中藥組顯著高于空白對(duì)照組和抗生素組(P<0.05)；在第21天，中藥組顯著高于抗生素組(P<0.05)，但與空白對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

表1 加味二術(shù)散對(duì)斷奶仔豬空腸黏膜抗氧化能力的影響

2.2 腸黏膜免疫結(jié)果分析

斷奶仔豬腸黏膜免疫指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果見表2。由表2可知，中藥組仔豬空腸黏膜中IL-2含量，在第14天顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，在試驗(yàn)第7和21天與空白對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)；在試驗(yàn)7，14和21天均顯著高于抗生素組(P<0.05)。中藥組空腸黏膜中SIg A含量，在試驗(yàn)第7天與空白對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，第14和21天顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)；在試驗(yàn)7，14和21天均顯著高于抗生素組(P<0.05)。

表2 加味二術(shù)散對(duì)斷奶仔豬腸空腸黏膜免疫能力的影響

3 討 論

腸道不僅是食物消化、吸收和代謝的主要器官，物質(zhì)代謝和能量代謝非常旺盛，而且是重要的分泌和免疫器官，因此極易受到過量的氧自由基的攻擊而發(fā)生疾病[5]。斷奶應(yīng)激可導(dǎo)致仔豬腸道菌群失調(diào)，有益菌數(shù)量降低，條件致病菌尤其是大腸桿菌增殖，粘附在微絨毛上的大腸桿菌分泌大量的內(nèi)毒素，最終導(dǎo)致腸道發(fā)生炎癥。巨噬細(xì)胞在炎癥區(qū)聚集、激活，其耗氧量增加，機(jī)體抗氧化能力下降，通過一系列反應(yīng)，產(chǎn)生大量的OH-、O2-及脂質(zhì)過氧化物，在體內(nèi)引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，繼而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生氧化損傷，并分解出MDA，使細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)、大量Ca2+內(nèi)流，通過花生四烯酸代謝，形成具有高度生物活性的炎癥介質(zhì)，最終加重腸黏膜的損傷[3-4]。

中藥的功效與其抗氧化作用有密切關(guān)系，其中富含多種抗氧化成分，如酸類化合物、黃酮類化合物、皂苷、多糖等，混用幾種天然抗氧化劑往往可增加機(jī)體抗氧化能力。中藥可通過直接清除活性氧自由基、增強(qiáng)抗氧化酶活性、抗脂質(zhì)過氧化等作用，來維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，減小DNA損傷，對(duì)抗氧化酶系的作用，提高機(jī)體的抗氧化能力[6]。構(gòu)成加味二術(shù)散的5味中藥均具有抗氧化作用，其丹參中的丹參素、原兒茶醛、咖啡酸均具有抗氧化作用，復(fù)方丹參具有較強(qiáng)還原力，能清除DPPH和超氧陰離子自由基[7]；柴胡中的多糖具有抗氧化作用，其可能通過對(duì)補(bǔ)體的抑制作用而阻止氧自由基的產(chǎn)生[8]；陳皮中的黃酮具有較強(qiáng)的抑制有機(jī)自由基DPPH和羥自由基的抗氧化活性[9]；蒼術(shù)中的乙酸乙酯可清除DPPH和ABTS自由基[10]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，中藥組仔豬空腸黏膜中T-SOD酶活力在試驗(yàn)第7和14 天顯著高于空白對(duì)照組；CAT活力在試驗(yàn)的第7天顯著高于空白對(duì)照組和抗生素組；MDA含量在試驗(yàn)第14天顯著低于空白對(duì)照組和抗生素組；T-AOC在第14天顯著高于空白對(duì)照組和抗生素組。以上結(jié)果均說明，加味二術(shù)散有提高斷奶仔豬腸黏膜抗氧化能力的功效。由此筆者推斷，加味二術(shù)散可通過提高腸黏膜抗氧化功能而減小應(yīng)激對(duì)腸黏膜的損傷作用。

腸黏膜免疫是宿主體內(nèi)的重要防御系統(tǒng)。有研究顯示，應(yīng)激會(huì)影響機(jī)體細(xì)胞因子的產(chǎn)生和免疫細(xì)胞的功能[11-12]。IL-2由Th1細(xì)胞產(chǎn)生，在黏膜免疫中起著重要的調(diào)節(jié)作用[13]，斷奶應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致仔豬機(jī)體內(nèi)的IL-2水平下降[14-15]。SIg A是胃腸道和黏膜表面主要的免疫球蛋白,對(duì)消化道黏膜起著重要的保護(hù)作用。腸腔內(nèi)的SIg A通過結(jié)合細(xì)菌而將腸道內(nèi)細(xì)菌聚集起來,形成抗原抗體復(fù)合物,刺激腸道黏液的分泌，并加速黏液在腸黏膜表面的移動(dòng),有助于排除腸道中的細(xì)菌和內(nèi)毒素。因此，SIg A在保護(hù)消化道防御機(jī)制中起著重要的作用。中藥可增強(qiáng)斷奶仔豬機(jī)體的免疫功能[16]。研究表明，植物多糖類化合物是一種免疫調(diào)節(jié)劑，可激活免疫細(xì)胞，改善機(jī)體免疫功能[17]。本試驗(yàn)加味二術(shù)散中的白術(shù)可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，其糖蛋白可誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌[18-20]，白術(shù)多糖具有促進(jìn)免疫器官和機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育的作用；蒼術(shù)中的多糖可調(diào)節(jié)腸黏膜免疫應(yīng)答[21-22]；丹參中的丹參素可激活單核巨噬細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能[18]。方劑中，丹參中的內(nèi)酯A和柴胡中的某些皂苷均具有免疫調(diào)節(jié)作用，后者還有顯著的抗炎作用[23-24]。陳皮提取物可提高免疫器官指數(shù)和血清中免疫球蛋白的含量[25]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，中藥組仔豬空腸黏膜中IL-2和SIg A含量在試驗(yàn)第14天均顯著高于空白對(duì)照組，在第14和21天時(shí)中藥組空腸黏膜中SIg A的含量均顯著高于空白對(duì)照組，據(jù)此筆者推測(cè)，加味二術(shù)散對(duì)空腸黏膜的免疫力有一定的改善作用；在試驗(yàn)第7和21天，中藥組空腸黏膜中的IL-2含量與空白對(duì)照組雖然差異不顯著，但含量較空白對(duì)照組高。有研究顯示，有些抗生素具有降低機(jī)體免疫力的作用[26]，在本試驗(yàn)中抗生素組的IL-2和SIg A含量顯著低于中藥組，所以可推斷本試驗(yàn)所用抗生素可能也有降低機(jī)體免疫力的作用，但仍需進(jìn)一步的試驗(yàn)證實(shí)。

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