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    獨(dú)角蓮中酪氨酸酶活性抑制成分的提取工藝研究

    2014-03-26 02:25:04宋艷玲杜新春殷連保戴宏斌
    關(guān)鍵詞:獨(dú)角提物酪氨酸

    宋艷玲, 杜新春, 龐 穎, 殷連保, 張 毅, 戴宏斌

    (沈陽(yáng)化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院, 遼寧 沈陽(yáng) 110142)

    獨(dú)角蓮(TyphoniumgiganteumEngl.) 為天南星科(Araceae) 犁頭尖屬(Typhonium Schott) 植物,是中國(guó)特有的一種植物,主要產(chǎn)于河南、四川、陜西等地,現(xiàn)全國(guó)各地亦多栽培,東北地區(qū)產(chǎn)量極高,且價(jià)格較低廉.《民間草藥》、《中藥大辭典》記載,獨(dú)角蓮球莖供藥用,逐寒濕,祛風(fēng)痰,鎮(zhèn)痙,治中風(fēng)痰壅、口眼歪斜、破傷風(fēng)、跌打損傷、淋巴結(jié)核[1].迄今為止,對(duì)這種植物的使用多用于民間偏方,其有效活性成分的研究及應(yīng)用仍處于開(kāi)發(fā)階段.文獻(xiàn)報(bào)道,獨(dú)角蓮水提物對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)具有明顯的抑制作用[2-5].酪氨酸激酶在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路中具有十分重要的作用,它和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移具有密切的關(guān)系,成為目前抗腫瘤藥物的重要研究靶點(diǎn)[6-7].本實(shí)驗(yàn)對(duì)獨(dú)角蓮采用水提法提取,測(cè)定獨(dú)角蓮在不同提取工藝條件下的提取物對(duì)酪氨酸酶活性的相對(duì)抑制率,從中篩選出最佳的提取工藝.

    1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

    721型分光光度計(jì);DF1015-集熱式磁力加熱攪拌器;DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱;SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵;電子分析天平.

    1.2 實(shí)驗(yàn)材料

    獨(dú)角蓮鮮球根莖(市售,產(chǎn)地為吉林)洗凈,切成約5 mm的厚片, 經(jīng)50 ℃烘干,粉碎,過(guò)100目篩,備用;L-酪氨酸(上海伯奧生物科技有限公司);酪氨酸激酶(上海江萊生物科技有限公司).

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 獨(dú)角蓮水提物的提取工藝研究

    利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法,選取提取時(shí)間A、料液比B、提取溫度C、提取次數(shù)D作為4個(gè)考察因素,每個(gè)因素選擇3個(gè)水平,按照L9(34)正交表(表1)進(jìn)行試驗(yàn).以1號(hào)實(shí)驗(yàn)為例,稱取獨(dú)角蓮粗粉50 g,置圓底燒瓶?jī)?nèi),用5倍質(zhì)量比的蒸餾水,在50 ℃提取1 h,提取次數(shù)1次.提取結(jié)束后,將提取液減壓濃縮至干,置烘箱中干燥至恒質(zhì)量,得干浸膏.其余試驗(yàn)按正交表設(shè)定的條件依次進(jìn)行.

    表1 獨(dú)角蓮水提物提取的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    1.3.2 酪氨酸酶抑制活性測(cè)定

    Folin試劑可與酪氨酸的酚羥基作用生成深藍(lán)色化合物,該物質(zhì)可以用比色法測(cè)定.酪氨酸如果被酪氨酸激酶分解,將不能與福林試劑發(fā)生顯色反應(yīng),通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)得的混合液的吸光度會(huì)有所降低.由于酶抑制劑的抑制活性不同,所形成的藍(lán)色化合物量不同,通過(guò)測(cè)定吸光度的變化可計(jì)算樣品對(duì)酪氨酸酶的抑制率.將上述各次提取實(shí)驗(yàn)所得到的浸膏分別稱取10 mg置于10 mL容量瓶中,分別加蒸餾水溶解并稀釋至質(zhì)量濃度為1 g/L,備用.取1 mg酪氨酸酶用磷酸緩沖液稀釋至5 mL備用.準(zhǔn)確吸取pH6.8磷酸鹽緩沖液1 mL、摩爾分?jǐn)?shù)為0.2 %酪氨酸溶液1 mL及Folin試劑,開(kāi)始反應(yīng),整個(gè)反應(yīng)在37 ℃的恒溫中持續(xù)20 min,于680 nm 處測(cè)定吸光度A0.在上述實(shí)驗(yàn)條件下,再分別準(zhǔn)確吸取0.2 g/L酪氨酸酶試液1 mL、提取物樣品和0.2 g/L酪氨酸酶試液各1 mL、提取物樣品1 mL,分別進(jìn)行反應(yīng)后對(duì)應(yīng)測(cè)定吸光度分別為A1、A2、A3.酪氨酸激酶的抑制活性可以按以下公式計(jì)算:

    抑制率=[(A1-A0)-(A2-A3)]/(A1-A0)×100 %

    式中:A0空白對(duì)照品所測(cè)的吸光度;A1添加酪氨酸酶混合液所測(cè)的吸光度;A2添加提取物和酶的混合液所測(cè)的吸光度;A3添加提取物樣品混合液所測(cè)的吸光度.

    2 結(jié)果與討論

    2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

    正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2,從表2 得出最佳提取工藝條件為A3B3C2D1,即提取時(shí)間為3 h,料液質(zhì)量比為1∶15,提取溫度80 ℃,提取次數(shù)為1次的條件下,獨(dú)角蓮提取物對(duì)酪氨酸酶抑制活性較高.從表2中得到的極差大小可知:影響提取物抑制酪氨酸酶活性的主次因素順序?yàn)镃>B>D>A,即提取溫度的影響最顯著,其次為提取液用量,再次為提取次數(shù),最后為提取時(shí)間.

    按照正交試驗(yàn)結(jié)果所得到的最佳提取工藝條件,重復(fù)進(jìn)行3組平行驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表3,表明此提取工藝合理,穩(wěn)定,可行.

    表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

    表3 正交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

    2.2 討 論

    正交試驗(yàn)結(jié)果表明:提取溫度的控制對(duì)提取物抑制酪氨酸酶活性的影響較大.溫度較低(50 ℃)情況下,有可能不利于獨(dú)角蓮中有效活性成分的提取,影響提取物抑制酪氨酸酶活性.溫度過(guò)高(100 ℃),提取物抑制率也有所下降,可能是由于高溫使得部分活性化合物分解.提取液用量在料液質(zhì)量比1∶5與1∶10之間對(duì)提取物抑制酪氨酸酶活性的影響較大,而對(duì)于料液質(zhì)量比1∶10與1∶15之間對(duì)提取物抑制酪氨酸酶活性的影響較微弱,一般情況下,可選用料液質(zhì)量比1∶10來(lái)減少資源的浪費(fèi).

    3 結(jié) 論

    設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),利用水提法對(duì)獨(dú)角蓮活性成分進(jìn)行提取,并進(jìn)行了酪氨酸酶抑制活性研究.結(jié)果表明:提取時(shí)間為3 h,料液質(zhì)量比為1∶15,提取溫度80 ℃,提取次數(shù)為1次的條件下,獨(dú)角蓮水提物抑制酪氨酸酶活性最強(qiáng),抑制率為46.93 %.通過(guò)3組平行試驗(yàn)驗(yàn)證了該提取工藝的優(yōu)化性.獨(dú)角蓮水提物作為一種有效的酪氨酸酶抑制劑,具有進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)的價(jià)值.

    參考文獻(xiàn):

    [1] 侯家玉.中藥藥理學(xué)[M].2版.北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2006:106.

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    [3] 王順啟,倪虹,王問(wèn)順,等.獨(dú)角蓮水提取物對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721基因表達(dá)的影響[J].中草藥,2006,37(9):1384-1387.

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    [7] 姜秋紅,程能能,高慧君.以酪氨酸激酶信號(hào)通路為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物研究進(jìn)展[J].中國(guó)臨床藥學(xué)雜志,2011,20(6):379-383.

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