岷山紅三葉根際優(yōu)良促生菌對(duì)其宿主生長(zhǎng)和品質(zhì)的影響

榮良燕，姚拓，馬文彬，李德明，李儒仁，張潔，陸颯

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室，甘肅 蘭州730070；3.甘肅省草原技術(shù)推廣總站，甘肅 蘭州730046；4.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州730070）

長(zhǎng)期以來(lái)，為了滿足農(nóng)作物生長(zhǎng)所需的氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素，工業(yè)化肥一直被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的主要途徑。然而，隨著化肥使用量不斷增大，其負(fù)面影響日益明顯，如導(dǎo)致土壤結(jié)構(gòu)破壞、肥力下降，造成土壤微生物區(qū)系多樣性破壞等諸多問(wèn)題，并且由于生產(chǎn)化肥引起的水質(zhì)、空氣污染，非再生能源的大量消耗，食品安全等問(wèn)題已成為困擾農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要因素［1］。近年來(lái)，隨著人們生態(tài)保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)以及對(duì)無(wú)公害農(nóng)作物生產(chǎn)的日益重視，探尋新的肥料來(lái)源（尤其是生物肥料）以替代工業(yè)化肥的研究倍受關(guān)注。

岷山紅三葉（Trifoliumpratensecv.Minshan）屬高產(chǎn)型優(yōu)質(zhì)牧草，營(yíng)養(yǎng)全面，再生性強(qiáng)，并且含有大量的異黃酮多酚化合物。研究資料表明，異黃酮具有較強(qiáng)的清除自由基能力，岷山紅三葉中可提取的異黃酮含量（1.0%～2.6%）遠(yuǎn)高于大豆異黃酮（0.1%～0.3%）［2］。為了滿足紅三葉生存、生產(chǎn)所需的氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素，大量化學(xué)肥料被用于紅三葉以獲得較高產(chǎn)量。然而，在經(jīng)濟(jì)落后、土壤貧瘠的地區(qū)，大量使用化肥不但增加了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，而且造成了環(huán)境及食品污染，同時(shí)隨著化肥施用量的增加，出現(xiàn)了肥效降低、利用率下降等現(xiàn)象。因此，探尋新的生物生態(tài)肥源，以實(shí)現(xiàn)對(duì)工業(yè)化肥的部分替代或完全替代的目標(biāo)已迫在眉睫。

植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是存在于植物根際或根表，可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)或拮抗病原菌的微生物。PGPR不僅可以分泌植物促生物質(zhì)（如植物激素、維生素、氨基酸、其他活性有機(jī)小分子衍生物等），還可以改善植物根際的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境（如PGPR在植物根際的代謝作用加強(qiáng)了土壤中有機(jī)物的分解，促進(jìn)了植物營(yíng)養(yǎng)元素的礦化，增加了作物的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)）。此外，PGPR還具有控制植物病害，降解土壤污染物的作用［3－4］。利用不同環(huán)境、不同植物群落根際分離、篩選的優(yōu)良促生菌研制的生物菌肥不僅具有以上優(yōu)點(diǎn)，還可以減少生產(chǎn)和使用農(nóng)藥、化肥帶來(lái)的環(huán)境和食品污染及非再生能源消耗。因此，土壤微生物資源的定向利用已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)研究出了可用于水稻（Oryzasativa）［5］、小麥（Triticumaestivum）［6］、玉米（Zea mays）［7］、番茄（Lycopersiconesculentum）［8］、櫻桃（Prunusavium）［9］等作物的微生物肥料，并且取得了良好的效果，但關(guān)于PGPR微生物肥料應(yīng)用于岷山紅三葉的研究報(bào)道很少。隨著西部生態(tài)環(huán)境建設(shè)和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整的不斷推進(jìn)，岷山紅三葉的種植面積逐年擴(kuò)大，其產(chǎn)業(yè)化功能在優(yōu)質(zhì)高效農(nóng)業(yè)發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。因此，選擇和評(píng)價(jià)適宜的岷山紅三葉微生物菌肥并將其推廣使用具有重要意義。本研究從適宜岷山紅三葉生長(zhǎng)的環(huán)境中分離篩選根際優(yōu)良促生菌，以制備有利于促生、防病綜合功能的環(huán)保型復(fù)合根際菌肥，并研究用其部分替代化肥后對(duì)岷山紅三葉生長(zhǎng)及營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響，為微生物肥源部分替代化肥以減少購(gòu)買(mǎi)性投入量，實(shí)現(xiàn)微生物資源定向利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

采樣地位于甘肅岷縣岷山紅三葉種植基地，選擇生長(zhǎng)旺盛的岷山紅三葉植株，附帶根及周?chē)寥?，裝入無(wú)菌封口袋中，4℃保存。

1.2 岷山紅三葉根際促生菌的篩選

1.2.1 初篩 將采集到的植株抖掉附著在根上的土壤，用無(wú)菌刷子收集根表層土壤，稱(chēng)取10g加入90mL無(wú)菌蒸餾水中，28℃下?lián)u床震蕩30min［10］。采用稀釋法將菌懸液逐步稀釋后涂布于PKO（Pikovaskaia’s）平板培養(yǎng)基上［10］，3～4個(gè)重復(fù)，28℃培養(yǎng)10d。觀察平板上菌落生長(zhǎng)及菌落周?chē)该魅η闆r，計(jì)算透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）的比值并記錄，D/d比值越大，溶磷能力越強(qiáng)。挑取菌落生長(zhǎng)飽滿，透明圈明顯的單菌落保存。

1.2.2 復(fù)選 對(duì)初篩得到的菌株進(jìn)行繼代培養(yǎng)，1個(gè)月后將各菌株點(diǎn)接種至PKO平板上，計(jì)算D/d值，篩選出穩(wěn)定產(chǎn)生透明圈的菌株，挑取整個(gè)單菌落接種在PKO液體培養(yǎng)基中，28℃，160r/min搖床培養(yǎng)13d。4℃，10000r/min離心15min，取上清液，以未接菌的培養(yǎng)液為對(duì)照，測(cè)定發(fā)酵液的pH值，并采用鉬銻抗比色法測(cè)定菌液中有效磷增量，篩選出溶磷量較高的菌株，4℃斜面保存［11］。

1.3 促生菌株促生性能測(cè)定

對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行固氮酶活性、分泌吲哚－3－乙酸（indole－3－acctic acid，IAA）能力、拮抗病原菌能力的測(cè)定。固氮酶活性采用乙炔還原法（acelylene reduction assay，ARA）測(cè)定［7］，分泌IAA能力采用Salkowski比色法測(cè)定［11］，拮抗病原菌能力采用平板對(duì)峙法測(cè)定［12］。

1.4 岷山紅三葉根瘤菌的分離與純化

選取生長(zhǎng)飽滿、直徑較大的根瘤，無(wú)菌水浸泡并沖洗3～5次，95%的乙醇浸泡30s，0.1%HgCl消毒5min，無(wú)菌水沖洗數(shù)次。用滅菌鑷子夾破根瘤劃線涂布在YMA（酵母甘露醇瓊脂）平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出后挑取典型菌落劃線培養(yǎng)，出現(xiàn)單菌落后4℃冰箱保存。

1.5 岷山紅三葉復(fù)合菌肥的制作

1.5.1 菌株懸浮液及菌肥的制作 分別接種各優(yōu)良PGPR菌株于50mL LB（Luria－Bertani，溶菌肉湯）液體培養(yǎng)基中，28℃，125r/min培養(yǎng)48h。待菌株充分生長(zhǎng)后，用無(wú)菌水調(diào)節(jié)各菌株菌懸液濃度為1×108cfu/mL（波長(zhǎng)660nm，OD值≥0.5）。300mL三角瓶?jī)?nèi)裝入100mL LB液體培養(yǎng)基，滅菌后置于室溫下1～2d，經(jīng)檢查無(wú)污染后分別接種20mL上述各菌懸液，于28℃，125r/min培養(yǎng)2～3d，將菌液注入滅菌玻璃瓶中常溫密封保存?zhèn)溆?。根瘤菌接種于YMA液體培養(yǎng)基中，其他方法同PGPR菌肥制作方法。

1.5.2 根際復(fù)合菌肥的制作 根際復(fù)合菌肥的制作參考韓華雯等［13］的方法。取PGPR菌和根瘤菌發(fā)酵液于室溫下1～2h，無(wú)菌環(huán)境下，將兩者按一定比例混合即可（菌株種類(lèi)和比例正在申報(bào)專(zhuān)利）。

1.5.3 復(fù)合微生物菌肥的質(zhì)檢 采用平板計(jì)數(shù)法和顯微觀察計(jì)數(shù)法，具體方法參考《農(nóng)用微生物菌劑》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［14］。在儲(chǔ)藏15，30，60，90，120，150，180，210，240，270d各檢查一次，同時(shí)觀察菌肥是否有霉變、異味等產(chǎn)生，若有效活菌數(shù)達(dá)1×108cfu/mL以上且無(wú)污染方可認(rèn)為菌肥質(zhì)量達(dá)標(biāo)。

1.6 盆栽試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法

1.6.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)種子：岷山紅三葉由甘肅省草原技術(shù)推廣總站提供，純凈度≥94%，發(fā)芽率≥88%?；瘜W(xué)肥料：尿素（含N 46%），磷二銨（含P 46%，N 18%）。生物菌肥：岷山紅三葉根際復(fù)合促生菌肥（即1.5中制作出的復(fù)合菌肥）。

花盆直徑0.22m，深0.17m。盆栽土壤：土與營(yíng)養(yǎng)土比例為2∶1，加入珍珠鹽（混合土∶珍珠巖，20∶1）和少量垤石。土壤養(yǎng)分pH 7.05，有機(jī)質(zhì)含量25.8%，有效氮75.05mg/kg，有效磷12.91mg/kg，有效鉀180.29 mg/kg。

稱(chēng)取混合土壤2.5kg，添加0.4g尿素，0.9g磷二銨，混勻后裝盆。選取飽滿種子50粒于2012年9月底播種，播種深度1～2mm。2013年5月中旬、8月底分兩次采集盆栽植株樣品并分別測(cè)定產(chǎn)量、品質(zhì)及異黃酮含量等。

1.6.2 促生菌肥使用方法及使用量 播種前種子用菌肥拌種，置陰涼處2h，待菌肥附著在種子表面后即可播種。

1.6.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理、1個(gè)對(duì)照。CK：全量化肥；A：菌肥；B：25%化肥＋菌肥；C：50%化肥＋菌肥；D：75%化肥＋菌肥。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.6.4 測(cè)定指標(biāo) 干草產(chǎn)量，收獲各處理的盆栽植株，常溫下完全風(fēng)干至恒重，稱(chēng)量后計(jì)算平均值。

營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)測(cè)定，將岷山紅三葉青干草用錘式粉碎機(jī)粉碎，粉碎機(jī)篩孔直徑為0.6mm。粗蛋白（CP）采用凱氏定氮法測(cè)定。粗灰分（CA）采用馬弗爐（550℃）直接灰化法測(cè)定。中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）分別采用Van Soest法和Roberston法測(cè)定。全磷量采用鉬銻抗比色法測(cè)定。鈣以EDTA絡(luò)合滴定法測(cè)定［15］。

異黃酮含量測(cè)定方法：采用高效液相色譜分析儀進(jìn)行測(cè)試［16］。色譜條件：Lichrospher C18色譜柱（2.6mm×250mm），柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm；流動(dòng)相：甲醇－水－1%乙酸0～50min，15%甲醇（含1%乙酸）－80%甲醇（含1%乙酸）梯度洗脫，流速：0.3mL/min，進(jìn)樣量：5μL。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010處理數(shù)據(jù)，使用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Origin 8.6繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際優(yōu)良促生菌、根瘤菌及其促生特性

從岷山紅三葉根際分離出129株根際促生菌，經(jīng)過(guò)測(cè)定菌株的生長(zhǎng)速度、溶磷量、分泌植物生長(zhǎng)激素量和對(duì)病原菌的拮抗作用，篩選出了6株根際優(yōu)良促生菌，同時(shí)從岷山紅三葉根部分離出1株根瘤菌（表1）。6株促生菌生長(zhǎng)速度均較快，菌株MHS7、MHS27兼具溶磷、分泌生長(zhǎng)激素及抑制病原菌（Fusariumoxysporiumf.sp.cucumerinum、Rhizoctoniasolani、Fusariumoxysporumf.niveum）的能力；菌株MHS19具有良好的分泌植物生長(zhǎng)激素的能力，菌株MHS30的溶磷量達(dá)到229.50 mg/L；1株根瘤菌屬于慢生型根瘤菌，其固氮酶活性達(dá)到488.20nmoL/（mL·h）。

表1 岷山紅三葉根際優(yōu)良促生菌、根瘤菌及其促生特性Table 1 Characteristics of growth promoting rhizobacteria and rhizobium from clover

2.2 菌肥質(zhì)量檢查

有效活菌數(shù)及菌劑是否被雜菌污染是表征菌肥質(zhì)量的重要指標(biāo)。表2顯示，制作的微生物菌肥在室溫條件下，0～30d時(shí)有效活菌數(shù)呈上升趨勢(shì)，30d時(shí)最高，為20.30×108cfu/mL，之后逐漸下降，在240d時(shí)有效活菌數(shù)均在108cfu/mL以上，并且無(wú)污染，270d時(shí)，菌肥中的有效活菌數(shù)下降至0.35×108cfu/mL，且伴有雜菌污染和霉變現(xiàn)象。因此，為了保證菌肥的質(zhì)量，該菌肥制作后應(yīng)當(dāng)在8個(gè)月內(nèi)使用。該菌肥符合《微生物肥料》NY227－94標(biāo)準(zhǔn)［17］。

表2 復(fù)合微生物菌肥質(zhì)量檢查T(mén)able 2 Quality check of compound microbial bacterial fertilizer

2.3 微生物菌肥對(duì)岷山紅三葉干草產(chǎn)量的影響

干草產(chǎn)量是衡量牧草生產(chǎn)能力的重要指標(biāo)。從表3可以看出，不同施肥處理對(duì)岷山紅三葉第1茬干草產(chǎn)量影響差異顯著（P＜0.05）。處理D干草產(chǎn)量顯著（P＜0.05）高于CK（9.23%），說(shuō)明75%化肥＋菌肥處理對(duì)岷山紅三葉具有顯著增產(chǎn)效果；處理C與CK相比無(wú)顯著差異，說(shuō)明該處理可以在不減產(chǎn)的同時(shí)，減少50%化肥的用量，從而有效降低生產(chǎn)成本；處理A、B與CK相比差異顯著（P＜0.05），產(chǎn)量顯著低于CK（第1茬）。各菌肥處理對(duì)岷山紅三葉干草產(chǎn)量的增產(chǎn)效果主要體現(xiàn)在第1茬，處理C、D與CK相比，第2茬干草產(chǎn)量沒(méi)有顯著差異，但處理C、D略高于CK，這可能是由于菌肥在植株生長(zhǎng)后期促生效果相對(duì)減弱造成。紅三葉總干草產(chǎn)量也因不同菌肥處理而呈現(xiàn)出不同規(guī)律，其中處理D（75%化肥＋菌肥）效果最好，較CK高4.77%。

表3 不同施肥處理對(duì)岷山紅三葉干草產(chǎn)量的影響Table 3 Effect of different fertilizer application on dry yield of clover g/盆Pot

2.4 微生物菌肥對(duì)岷山紅三葉營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響

2.4.1 微生物菌肥對(duì)岷山紅三葉粗蛋白、粗灰分、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維的影響 不同菌肥處理后岷山紅三葉粗蛋白含量差異顯著（P＜0.05）（表4）。處理D（75%化肥＋菌肥）效果明顯優(yōu)于CK，第1、2茬粗蛋白含量分別比CK高11.25%和11.56%。處理C（50%化肥＋菌肥）與CK相比無(wú)顯著性差異，處理A和B使用效果均不及CK。各處理對(duì)兩茬岷山紅三葉中蛋白質(zhì)含量變化影響較大，這可能與播種前為岷山紅三葉種子接種根瘤菌有關(guān)，其固氮效果明顯增加。

PGPR菌肥對(duì)兩茬岷山紅三葉粗灰分含量均有明顯影響（表4）。兩茬紅三葉中粗灰分含量在各處理間差異顯著（P＜0.05），岷山紅三葉中粗灰分含量由高到低依次為：處理D＞處理C（對(duì)照CK）＞處理B＞處理A。

各施肥處理對(duì)兩茬岷山紅三葉中性洗滌纖維含量影響顯著（P＜0.05）（表4），第1茬中處理D與CK之間差異顯著（P＜0.05），處理D較CK中性洗滌纖維含量顯著下降7.55%，處理C與CK之間差異不顯著，處理A的NDF含量最高。第2茬處理CK、處理C與處理D之間差異均不顯著，處理D的NDF含量最低。

兩茬岷山紅三葉酸性洗滌纖維含量因處理不同而存在明顯差異（表4）。各處理中，除兩茬處理D和第1茬處理C的ADF含量較CK有所降低之外，其余各處理ADF含量均高于CK，其中第1茬中處理C、處理D較CK分別降低4.50%和7.54%。第2茬處理C、處理D與CK之間差異不顯著，處理A的ADF含量最高。

表4 不同施肥處理下岷山紅三葉粗蛋白（CP）、粗灰分（CA）、中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）含量比較Table 4 Effect of different fertilizer application on crude protein（CP），crude ash（CA），neutral detergent fiber（NDF）and acid detergent fiber（ADF）content of clover %

2.4.2 微生物菌肥對(duì)岷山紅三葉鈣、磷含量的影響 岷山紅三葉鈣含量因菌肥不同而差異顯著（P＜0.05）。除處理A外，其余處理紅三葉含量均是第1茬高于第2茬，菌肥處理替代75%（處理B）化肥較CK鈣含量顯著下降15.38%（第1茬）、28.16%（第2茬）。第1茬，處理C（50%化肥＋菌肥）與CK差異不顯著，處理D（75%化肥＋菌肥）顯著高于CK 13.33%（P＜0.05）。第2茬，處理C、D與CK鈣含量差異不顯著（圖1）。

復(fù)合菌肥不同處理對(duì)岷山紅三葉磷含量影響明顯，單施菌肥（處理A），岷山紅三葉磷含量在第1茬較CK顯著下降18.52%（P＜0.05），第2茬下降24.79%；菌肥替代75%化肥（處理B），兩茬植株磷含量均有所下降，但下降幅度不明顯。并且，第1茬的下降幅度低于第2茬。菌肥代替50%化肥（處理C），岷山紅三葉磷含量較CK顯著增加12.35%（第1茬）（P＜0.05），8.26%（第2茬），而處理D與C雖有差異，但不顯著（圖2）。

2.5 微生物菌肥對(duì)岷山紅三葉異黃酮含量的影響

從表5可以看出，與CK相比，處理C、D對(duì)岷山紅三葉中大豆黃素的含量無(wú)顯著影響；處理A、B（第1茬）和處理A（第2茬）使大豆黃素的含量較CK下降37.5%，12.5%，42.1%。岷山紅三葉中染料木黃酮的含量在兩茬之間的變化規(guī)律與大豆黃素大致相同，處理C、D與CK相比并無(wú)顯著性差異。此外，處理D顯著提高了兩茬紅三葉中刺芒柄花素的含量（P＜0.05）。作為4種異黃酮中含量最高的鷹嘴豆芽素，處理C、D與CK間無(wú)顯著性差異，處理A、B顯著降低，說(shuō)明減少一半以上化肥用量會(huì)對(duì)植株的異黃銅含量產(chǎn)生較大影響，其含量明顯降低，而處理C可以在不降低異黃酮含量的情況下節(jié)省50%化肥的消耗。

圖1 不同施肥處理下岷山紅三葉鈣含量的比較Fig.1 Comparison to calcium content of clover under different fertilizer application

圖2 不同施肥處理下岷山紅三葉磷含量的比較Fig.2 Comparison to phosphorus content of clover under different fertilizer application

表5 不同施肥處理下紅三葉異黃酮含量比較Table 5 Effect of different fertilizer application on isoflavone content of clover %

3 討論

3.1 根際優(yōu)良促生菌（PGPR）對(duì)岷山紅三葉生長(zhǎng)的影響

土壤中氮、磷缺乏，有效利用率低是制約農(nóng)作物增產(chǎn)增收的主要因素，微生物菌肥的研究利用為解決這一問(wèn)題提供了有效途徑。接種具有較高固氮酶活性的根瘤菌可以通過(guò)其生物固氮途徑為作物提供環(huán)保的氮肥［18］，接種優(yōu)良溶磷菌可以轉(zhuǎn)化土壤中難以吸收利用的磷進(jìn)而被植物吸收利用［19］。研究發(fā)現(xiàn)，將具有固氮、溶磷特性的PGPR菌肥應(yīng)用于蘋(píng)果樹(shù)（Malusdomestica）［20］、草莓（Fragaria×ananassa）［21］、青稞（Hordeumvulgare）［22］、甘蔗（Saccharum）［23］取得了良好的效果。本研究也發(fā)現(xiàn)，將岷山紅三葉根際分離出的根際促生菌（MHS30溶磷量229.50mg/L）與根部分離的根瘤菌MHSG1（固氮酶活性488.20C2H4nmol/mL·h）結(jié)合使用可以使岷山紅三葉增產(chǎn)。此外，許多PGPR可通過(guò)自身代謝產(chǎn)生吲哚乙酸、脫落酸、細(xì)胞分裂素、赤霉素等植物激素，進(jìn)而促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，調(diào)節(jié)植物的生命活動(dòng)［8，24－25］。從表1可以看出，從岷山紅三葉根際分離的MHS19根際細(xì)菌分泌IAA能力較強(qiáng)（12.01μg/mL），IAA對(duì)岷山紅三葉根長(zhǎng)以及根毛增生有良好的促進(jìn)作用，這可能是岷山紅三葉在減量施用化肥之后還可以保持較高產(chǎn)量的重要原因之一。類(lèi)似結(jié)論出現(xiàn)在其他研究中，Shahab等［26］發(fā)現(xiàn)，PGPR培養(yǎng)液中可以檢測(cè)到吲哚乙酸和吲哚丁酸，這兩類(lèi)物質(zhì)有助于促進(jìn)綠豆根徑的生長(zhǎng)。Wahyudi等［27］從印度尼西亞大豆（Glycinemax）根際分離得到的118株芽孢桿菌中，有76.3%具有促生能力，并且都會(huì)分泌吲哚乙酸。由此可見(jiàn)，PGPR產(chǎn)生的植物生長(zhǎng)激素在植物促生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。PGPR的促生作用除了固氮、溶磷、分泌IAA外，還可以通過(guò)脂多糖、鐵載體和水楊酸等介導(dǎo)使植物對(duì)疾病和病原菌產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，進(jìn)而對(duì)細(xì)菌、真菌和病毒產(chǎn)生拮抗作用，以達(dá)到防治病害的目的［28］。從岷山紅三葉根際分離的菌株MHS27具有拮抗病原菌Rhizoctoniasolani、Fusariumoxysporumf.niveum的能力，將不同種類(lèi)的PGPR菌株混合可能有助于產(chǎn)生更強(qiáng)的誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性，從而提高岷山紅三葉的抗病能力［29］，因此，岷山紅三葉的增產(chǎn)效果離不開(kāi)PGPR誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性作用的發(fā)揮。這一促生機(jī)制已經(jīng)在番茄和辣椒（Capsicumannuum）的研究當(dāng)中得到了證實(shí)［30］。除以上作用機(jī)制外，PGPR還可以通過(guò)以下途徑發(fā)揮促生作用，如：接種關(guān)鍵酶（如：ACC脫氨酶，幾丁質(zhì)酶等），或產(chǎn)生胞外多糖、根瘤菌毒素等［31］。其中，根瘤菌毒素在ACC脫氨酶作用的上游切斷ACC合成路徑，通過(guò)減弱高乙烯濃度對(duì)作物的脅迫并提高作物結(jié)瘤進(jìn)而促進(jìn)作物根系生長(zhǎng)。另外，PGPR自身產(chǎn)生ACC脫氨酶，裂解乙烯前體物質(zhì)ACC，降低植物體內(nèi)的乙烯濃度，抑制乙烯對(duì)植物的三重反應(yīng)，提高養(yǎng)分吸收和陽(yáng)光的捕獲面積，增加植物干物質(zhì)積累，擴(kuò)增根部組織，增強(qiáng)植物對(duì)根際微生物分泌或分解的促生物質(zhì)和土壤養(yǎng)分的有效利用，進(jìn)而促進(jìn)生長(zhǎng)［32］。

3.2 根際優(yōu)良促生菌（PGPR）對(duì)岷山紅三葉品質(zhì)的影響

研究資料表明，微生物復(fù)合菌肥可以有效促進(jìn)作物生長(zhǎng)使其增產(chǎn)，降低生產(chǎn)成本，而且在改善作物營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)方面也具有較大潛力。通過(guò)研究PGPR復(fù)合菌肥對(duì)岷山紅三葉的施用效果發(fā)現(xiàn)，75%化肥＋菌肥的處理使紅三葉中粗蛋白、粗灰分、鈣、磷及異黃酮的含量較CK都有所增加。出現(xiàn)這樣的結(jié)果與復(fù)合菌肥的溶磷作用及產(chǎn)生IAA有關(guān)，也可能是因?yàn)榫手械奈⑸飬f(xié)同作用的結(jié)果。菌肥中的有益微生物可分解釋放土壤中被固定的養(yǎng)分供作物吸收利用，如解磷微生物分泌出的有機(jī)酸可以降低土壤pH，提高P、Ca、Fe、Mn等礦物元素的有效利用率［33－35］。此外，植物體內(nèi)主要礦質(zhì)元素（P、Ca、Fe、Mn、Zn）的吸收利用與乙烯濃度有很大關(guān)聯(lián)，作物體內(nèi)大量乙烯的產(chǎn)生會(huì)減少豆科作物根瘤的產(chǎn)生，影響其固氮效果，同時(shí)乙烯會(huì)抑制非豆科植物根的伸長(zhǎng)，阻礙植物對(duì)土壤中的礦質(zhì)元素的吸收和積累。Nadeem等［36］研究發(fā)現(xiàn)，降低乙烯濃度的關(guān)鍵是減少乙烯合成的前體ACC（1－氨基環(huán)丙烷－1－羧酸）的含量，PGPR產(chǎn)生的ACC脫氨酶將ACC脫氨基轉(zhuǎn)化為α－酮丁酸，降低植物體內(nèi)乙烯的合成，從而促進(jìn)作物生長(zhǎng)。這一研究成果在后續(xù)研究中得到了驗(yàn)證，研究發(fā)現(xiàn)在棉花（Gossypiumhirsutum）上接種包含ACC脫氨酶的菌株（Klebsiellaoxytoca）有助于提高主要營(yíng)養(yǎng)元素（如：N、P、K、Ca）的吸收利用率，促使作物礦物元素的積累增加，促進(jìn)作物根伸長(zhǎng)、干重增加［37］。與單一接種劑相比，復(fù)合接種劑的使用對(duì)于提高作物營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)具有明顯優(yōu)勢(shì)。類(lèi)似的結(jié)論在PGPR復(fù)合菌肥應(yīng)用于三葉草（Trifoliumrepens）［38］、山莓（Rubuscorchorifoliusf.）［39］的研究當(dāng)中也得到了證實(shí)。此外，適宜比例的化學(xué)肥料與微生物菌肥相結(jié)合的施用方式有助于提高土壤微生物種群密度，可以改善土壤微生態(tài)環(huán)境，提高土壤速效氮、磷、鉀的含量，最終顯著提高植物的肥料利用率［40－41］。

綜上可知，植物促生菌的促生效果僅僅依靠某種單一的促生途徑是無(wú)法實(shí)現(xiàn)的，通常通過(guò)幾種機(jī)制共同來(lái)發(fā)揮促生作用，并且促生效果與寄主植物以及土壤特性的綜合作用都有關(guān)系。PGPR復(fù)合菌肥的使用為岷山紅三葉增產(chǎn)提供了有效途徑，將PGPR與化學(xué)肥料配合使用的生產(chǎn)方式可以減少對(duì)非再生能源的大量消耗，減輕對(duì)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的破壞，對(duì)于提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)，食品安全性和可信度，保障農(nóng)牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有積極意義。然而，促生菌肥的應(yīng)用效果除了與施用區(qū)氣候特點(diǎn)、土壤狀況有關(guān)，還受到包括菌種來(lái)源、菌劑組成、施用量等因素的影響。因此，在本研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索PGPR微生物菌肥對(duì)岷山紅三葉的促生機(jī)理及其對(duì)土壤特性的影響，并優(yōu)化各類(lèi)影響因子，以期制備最佳的生物菌肥，選擇更適宜的化肥與菌肥配比，便于大面積推廣使用，為實(shí)現(xiàn)岷山紅三葉的環(huán)保型優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

本研究對(duì)甘肅岷縣地區(qū)獲得的植物根際促生菌進(jìn)行篩選，獲得6株優(yōu)良根際促生菌及1株根瘤菌，按照一定的比例混合制作根際復(fù)合微生物菌肥，并將其應(yīng)用于岷山紅三葉，盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明：75%化肥＋菌肥處理使岷山紅三葉干草總產(chǎn)量較CK增加4.76%，50%化肥＋菌肥處理在沒(méi)有顯著影響岷山紅三葉總干草產(chǎn)量的情況下可節(jié)省一半化肥。75%化肥＋菌肥的處理使紅三葉中粗蛋白、粗灰分、鈣、磷的含量較CK都有所增加，中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維相對(duì)降低；50%化肥＋菌肥的處理雖然沒(méi)有顯著提高紅三葉的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，但有助于減少化肥用量。通過(guò)測(cè)定各處理的岷山紅三葉異黃酮含量的結(jié)果表明采用微生物菌肥替代50%化肥的處理并沒(méi)有對(duì)4種異黃酮的含量造成顯著影響，但卻節(jié)省了50%化肥成本。

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