伊曲康唑納米乳的制備及含量測定

高 瑞，歐陽五慶

(西北農林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西 楊凌 712100)

伊曲康唑(Itraconazole，ITZ)，是一種廣譜的三唑類抗真菌藥物[1-2]，其耐受性好，親脂性強，極難溶于水[3]。ITZ通過抑制真菌細胞膜的重要成分之一麥角固醇的合成來發(fā)揮抗真菌作用[4]，而且ITZ對真菌細胞色素P450酶系統(tǒng)的親和力強于對動物細胞色素P450酶系統(tǒng)的親和力，故其毒性較低[5]。此外，ITZ在皮膚內的藥物代謝比較特殊，主要通過皮脂轉運，從而使得皮膚內的藥物濃度明顯高于血液，因此適用于皮膚真菌病的治療。目前用于臨床的ITZ制劑主要有口服溶液劑、膠囊和注射液等，但它們具有蓄積毒性大或生物利用度不穩(wěn)定等缺點[6-8]。

已有報道，許多香精油有抗真菌的作用[9-10]。肉桂醛(Cinnamaldehyde)作為肉桂香精油的重要成分之一，天然存在于樟樹的樹皮及葉子中[11]，其對細菌(包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌)和真菌(如酵母、絲狀霉菌、皮膚癬菌)均有抑殺作用[12]，此外還具有消毒、防腐、抗氧化等功能[13-14]，它難溶于水，易氧化、易揮發(fā)。

納米乳(Nanoemulsion)是一種納米級別的膠體分散體系，由于可以用來包封、保護以及傳遞親脂性藥物或生物活性物質，近年來被廣泛應用于食品和制藥行業(yè)，例如保健品、藥品、維生素、抗菌劑、抗氧化劑等[15-21]。納米乳由油、水、表面活性劑組成，粒徑通常小于100 nm，從而增強了其穩(wěn)定性[20]，增加了澄明度[19,21-23]，提高了生物利用度[18,23]。水包油(O/W)型納米乳是其類型之一。制備納米乳時，所用輔料一般具有良好的生物相容性，毒副作用小，以保證制得的納米乳安全可靠[24]。

本研究將ITZ制備成納米乳制劑，考察了伊曲康唑納米乳的理化性質，并建立了一種精確的伊曲康唑納米乳中伊曲康唑含量的測定方法，以期為臨床提供一種治療真菌感染的廣譜、高效、安全、穩(wěn)定的水包油型納米乳藥物。

1 材料與方法

1.1 主要藥品

伊曲康唑，西安博昌生物科技有限公司；肉桂醛，吉安市國光香料廠。

1.2 伊曲康唑納米乳的制備

1.2.1 混合油相的篩選 ITZ極難溶于水，但可溶于油相。待選油相有：有機類油相(乙酸乙酯、三乙酸甘油酯、乙酸丁酯)、中藥油類油相(肉桂醛)。將溶解度相對較好的有機類油相與肉桂醛按質量比 2∶1，1∶1，1∶2分3組混勻，分別測定其對ITZ的溶解度，選擇溶解度較大的組合作為混合油相。

1.2.2 表面活性劑的篩選 本試驗待選表面活性劑有EL-40、RH-40、吐溫-80。將這3種表面活性劑與篩選出的混合油相，在室溫下分別按質量比 9.5∶0.5，9∶1，8.5∶1.5，8∶2，7.5∶2.5，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8和1∶9混合?；靹蚝?，邊攪拌邊滴加蒸餾水，滴加速度為0.5 mL/min，攪拌速度為500 r/min。隨著滴加過程的進行，體系會先由稀變黏而后再由黏變稀，準確記錄由黏變稀時的用水量。利用Origin Pro 7.5 軟件繪制偽三元相圖，根據(jù)形成的乳區(qū)大小確定表面活性劑的種類。

1.2.3 助表面活性劑的篩選 預試驗發(fā)現(xiàn)，短鏈醇類助表面活性劑對ITZ的溶解性較好，為增大載藥量，在室溫下，選擇對ITZ有較好溶解性的短鏈醇作為助表面活性劑。本試驗從1,3-丁二醇、異丙醇和1,2-丙二醇中選擇。分別將3種助表面活性劑與ITZ、篩選出的混合油相、表面活性劑以及水按一定配比制成納米乳，60 ℃水浴30 min后考察其穩(wěn)定性，以此確定最終的助表面活性劑。

1.2.4 表面活性劑與助表面活性劑質量比(Km)的確定 室溫下，將篩選好的表面活性劑與助表面活性劑分別按質量比4∶1，3∶1，2∶1混勻，然后與篩選出的混合油相分別按質量比9.5∶0.5，9∶1，8.5∶1.5，8∶2，7.5∶2.5，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8和1∶9混勻，之后重復1.2.2中滴加蒸餾水的步驟，最后準確記錄用水量。分別以水相、油相、表面活性劑/助表面活性劑(Km)作為3個頂點，利用Origin Pro 7.5軟件繪制偽三元相圖，根據(jù)形成的乳區(qū)大小確定Km值。

1.2.5 伊曲康唑納米乳配方的確定 室溫下，先將ITZ按配方量加入篩選好的混和油相中，攪拌直到完全溶解；隨后，分別加入表面活性劑、助表面活性劑，攪拌混勻；最后，邊攪拌邊滴加蒸餾水，速度為0.5 mL/min，攪拌速度為500 r/min，即可制備出澄明透亮的伊曲康唑納米乳。

1.3 伊曲康唑納米乳結構類型的鑒別

用染色法判斷納米乳的類型。將油溶性蘇丹紅和水溶性次甲基藍分別滴到所制備的伊曲康唑納米乳中，觀察2種染色液的擴散速度，以此來判斷所制備納米乳的結構類型。若藍色的次甲基藍擴散速度大于紅色的蘇丹紅，則為水包油(O/W)型納米乳；反之，則為油包水(W/O)型納米乳[25]。

1.4 伊曲康唑納米乳的形態(tài)觀察及粒徑分布

取伊曲康唑納米乳適量，稀釋15倍，加2滴左右的分散劑(體積分數(shù)5%甘油)，用超聲波(33 Hz、50 W)振蕩處理0.5 h。然后分成2份，1份滴加在有Formvar膜的銅網(wǎng)上，用質量分數(shù)為2.0%的磷鎢酸負染150 s，自然干燥后，在透射電子顯微鏡下觀察納米乳的形態(tài)；另1份用激光粒度分析儀測定其平均粒徑和多分散系數(shù)(Polydispersity index,PDI)。

1.5 伊曲康唑納米乳的穩(wěn)定性考察

1.5.1 加速試驗 取適量伊曲康唑納米乳，置于離心管中，在4 500 r/min條件下離心45 min，考察其外觀。 取伊曲康唑納米乳適量，密封于棕色玻璃瓶內，于相對濕度75%，溫度分別為-4，25，40，60 ℃條件下保存，并分別于5和10 d后取樣，觀察其外觀是否發(fā)生相分離。

1.5.2 光照試驗 常溫下，將適量伊曲康唑納米乳密封于透明的西林瓶內，于(4 500±500) lx光照強度條件下，分別放置0，5，10 d，觀察其外觀形狀。

1.6 伊曲康唑納米乳中伊曲康唑含量的測定

1.6.1 檢測波長的確定以及方法專屬性的考察 準確稱取0.05 g伊曲康唑，用適量甲醇完全溶解，之后定容到50 mL容量瓶中，配制成1 mg/mL的伊曲康唑甲醇溶液。取適量該溶液稀釋成終質量濃度為0.2 mg/mL的溶液，此為樣品1。按照1.2.5中的方法制備載藥納米乳以及空白納米乳(配方中無伊曲康唑，其余同載藥納米乳)，分別取適量，均稀釋3 000倍，得到樣品2和樣品3。將上述3種樣品分別在200～500 nm的波長進行紫外掃描。

1.6.2 標準曲線的建立 分別取0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mL質量濃度為1 mg/mL的伊曲康唑甲醇溶液，用甲醇定容到5 mL，搖勻，得到 0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 mg/mL的伊曲康唑甲醇溶液，以甲醇作為空白對照，在檢測波長261 nm處分別測定其吸光度。以伊曲康唑甲醇溶液的質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，建立標準曲線，并求出回歸方程與相關系數(shù)。

1.6.3 回收率的測定 分別向空白納米乳中加入處方量(1 mg/mL)80%，100%和120%的伊曲康唑，經(jīng)過適當稀釋后，得到高(0.6 mg/mL)、中(0.5 mg/mL)、低(0.4 mg/mL)3種待測樣品。在261 nm處進行紫外掃描，每個處理做3個平行，記錄吸光度，求出實際質量濃度。利用求出的回歸方程計算回收率、平均回收率和相對標準偏差(RSD)，以考察檢測方法的準確度。

1.6.4 日內和日間精密度的測定 分別于同一天內的0，1，5，10，24 h時，取樣檢測0.4，0.5，0.6 mg/mL 待測樣品在261 nm處的吸光度，以評價日內精密度；再分別在一周內的0，1，3，5，7 d時，取樣檢測 0.4，0.5，0.6 mg/mL待測樣品在261 nm處的吸光度，共測5次，以評價日間精密度。

2 結果與分析

2.1 伊曲康唑納米乳的制備

2.1.1 混合油相的篩選 試驗結果表明，室溫下伊曲康唑在乙酸乙酯、三乙酸甘油酯、乙酸丁酯中的溶解度分別為0.7，0.6，0.5 g。故選擇溶解度較大的乙酸乙酯與肉桂醛按質量比2∶1，1∶1，1∶2分3組混勻，室溫下測得其對ITZ的溶解度分別為8.5，13.5，10.3 g。故選擇乙酸乙酯與肉桂醛質量比1∶1為混合油相。

2.1.2 表面活性劑的篩選 利用Origin Pro 7.5軟件繪制偽三元相圖篩選表面活性劑，結果見圖1。由圖1可知，EL-40、RH-40、吐溫-80 3種表面活性劑在一定配比范圍內均可形成澄明透亮的納米乳，且以EL-40為表面活性劑時，畫出的乳區(qū)(圖中的黑色部分)最大，故選擇EL-40為制備伊曲康唑納米乳的表面活性劑。

圖 1 表面活性劑對伊曲康唑納米乳制備的影響

2.1.3 助表面活性劑的篩選 預試驗表明，室溫條件下ITZ在異丙醇中的溶解度大于在1,3-丁二醇和1,2-丙二醇2種醇類中的溶解度。室溫下，3種助表面活性劑在一定配比范圍內均可形成澄明透亮的納米乳，但經(jīng)過30 min、 60 ℃水浴加熱后，由1，3-丁二醇和1，2-丙二醇作為助表面活性劑的納米乳變?yōu)槿榘咨?，而由異丙醇作為助表面活性劑的納米乳仍然澄明透亮。故選擇異丙醇作為制備伊曲康唑納米乳的助表面活性劑。

2.1.4 表面活性劑與助表面活性劑質量比(Km)的確定 以乙酸乙酯/肉桂醛為混合油相、EL-40為表面活性劑、異丙醇為助表面活性劑，利用Origin Pro 7.5軟件繪制偽三元相圖以確定Km值，結果見圖2。由圖2可知，當Km=2∶1時，形成的乳區(qū)(黑色部分)最大，故Km值確定為2∶1，即EL-40與異丙醇的最佳質量比為2∶1。

圖 2 不同Km值對伊曲康唑納米乳制備的影響

2.1.5 伊曲康唑納米乳配方的確定 伊曲康唑納米乳的配方確定為：伊曲康唑1.24%，肉桂醛 4.58%，乙酸乙酯4.58%，EL-40 24.44%，異丙醇12.17%，蒸餾水52.99%，以上均為質量分數(shù)。按該配方制備的伊曲康唑納米乳澄明透亮，稀釋后具納米乳特有的淡藍色乳光。

2.2 伊曲康唑納米乳的質量評價

2.2.1 伊曲康唑納米乳結構類型的鑒別 分別滴加蘇丹紅和次甲基藍于2份制備好的伊曲康唑納米乳樣品中，結果發(fā)現(xiàn)，水溶性的次甲基藍在納米乳樣品中迅速向四周擴散，而油溶性的蘇丹紅僅在納米乳樣品表面呈分層現(xiàn)象，次甲基藍在該納米乳中擴散速度明顯快于蘇丹紅，表明該納米乳是水包油(O/W)型納米乳。

2.2.2 伊曲康唑納米乳的形態(tài)觀察以及粒徑分布 透射電鏡下觀察到，制備的伊曲康唑納米乳乳滴呈圓球形，大小均一，分布均勻，分散性良好，無粘連(圖3)。粒度分析儀測定結果(圖4)顯示，伊曲康唑納米乳的平均粒徑為14.48 nm，多分散系數(shù)(PDI)為0.014，粒徑在1～25 nm的占100%。

2.2.3 伊曲康唑納米乳的穩(wěn)定性 在加速試驗中，各伊曲康唑納米乳樣品均保持外觀澄明均一，未發(fā)生相分離、絮凝或藥物析出等變渾濁的現(xiàn)象，說明所制備的納米乳穩(wěn)定性良好，耐儲存。在光照試驗中，該納米乳于(4 500±500) lx光照強度、常溫條件下分別放置0，5，10 d后外觀仍然保持淡黃色澄清透明，未出現(xiàn)分層、絮凝或藥物析出等現(xiàn)象，這表明該納米乳制劑對光照不敏感，對儲放條件的要求不高。

圖 3 伊曲康唑納米乳的透射電鏡觀察結果

圖 4 伊曲康唑納米乳的粒徑分布

2.3 伊曲康唑納米乳中伊曲康唑含量的測定

2.3.1 檢測波長的確定 稀釋的伊曲康唑溶液(樣品1)、伊曲康唑納米乳(樣品2)、空白納米乳(樣品3)在200～500 nm進行紫外掃描，結果見圖5。由圖5可見，伊曲康唑溶液的UV圖顯示雙峰，表示ITZ在261和266 nm 2個波長處均有吸收?？瞻准{米乳在284，224和220 nm處有不同強度的吸收，為減少干擾，選擇261 nm為檢測波長。伊曲康唑納米乳在284，266，261和213 nm處有紫外吸收。綜合分析認為，檢測波長選擇261 nm時，納米乳的各輔料(即空白納米乳)對于測定伊曲康唑納米乳中伊曲康唑含量無干擾，且該方法專屬性良好。

圖 5 伊曲康唑納米乳中伊曲康唑含量測定的波長選擇

2.3.2 標準曲線的建立 繪制的伊曲康唑溶液標準曲線見圖6，所得方程為y=2.135 2x+0.054 9，相關系數(shù)R2=0.999 7。該結果顯示，伊曲康唑標準液質量濃度為0.05～0.6 mg/mL時，其質量濃度與吸光度呈良好的線性關系。

2.3.3 回收率的測定 用空白納米乳制備0.6，0.5，0.4 mg/mL伊曲康唑樣品，檢測結果(表1)表明，該伊曲康唑納米乳的平均回收率是101.83%，相對標準偏差(RSD)是0.590 1%。說明所用檢測方法的回收率高、準確性好，納米乳中輔料(除伊曲康唑外的其他成分)對于伊曲康唑的測定干擾極小。

2.3.4 日內和日間精密度的測定 0.4，0.5，0.6 mg/mL 3個待測樣品日內和日間精密度的平均相對標準偏差分別為0.619 2%和0.832%。表明所用檢測方法精密度高，重現(xiàn)性好。

圖 6 伊曲康唑納米乳中伊曲康唑含量測定的標準曲線

表 1 伊曲康唑納米乳回收率的測定

3 討 論

納米乳通常由水相、油相、表面活性劑和助表面活性劑組成。將藥物溶解于油相中，制成O/W型納米乳，可以增加水溶性較差藥物的溶解度，提高制劑載藥量。此外，在形成的納米乳乳滴中，溶解有藥物的油相包裹于內核中，可以保護藥物，提高其穩(wěn)定性。而將制備好的納米乳通過皮膚給藥時，可以產(chǎn)生較高的滲透濃度梯度，皮膚藥物透過量較傳統(tǒng)乳劑明顯提高，Kreilgaard等[26]的研究證明了這一點。納米乳配方中組分及它們之間比例的確定對于納米乳的形成以及穩(wěn)定性有決定作用。若組分和比例恰當，則制備的納米乳澄清透明，且穩(wěn)定性好；若組分不恰當，則不能形成納米乳或者形成的納米乳穩(wěn)定性極差。本研究首先對油相進行了篩選，通過預試驗發(fā)現(xiàn)，待選油相單獨對伊曲康唑的溶解度均不理想，故考慮使用混合油相，將溶解度相對較好的乙酸乙酯與中藥油肉桂醛按照設計好的不同質量比混合，發(fā)現(xiàn)當質量比為1∶1時，其溶解度較單一的油相有很大提高。肉桂醛作為混合油相中的一種，既可以與乙酸乙酯協(xié)同增加伊曲康唑的溶解度，又可以與伊曲康唑協(xié)同增強抗真菌效果。在確定表面活性劑和Km值時，均以偽三元相圖中乳區(qū)最大為依據(jù)對配方進行優(yōu)選，使最終確定的配方組分以及它們之間的質量比為最優(yōu)。經(jīng)過篩選，確定各組分(質量分數(shù))為：伊曲康唑1.24%，肉桂醛4.58%，乙酸乙酯4.58%，EL-40 24.44%，異丙醇12.17%，蒸餾水52.99%，按此配方制備好的伊曲康唑納米乳在透射電鏡下呈圓球形且分散均一，其粒徑極小，且分布范圍狹窄，故形成的微小乳滴會加強藥物的透皮作用，促進透皮吸收[27]，從而增加藥物的療效，提高藥物的生物利用度。用建立的紫外分光光度法測定伊曲康唑含量簡單實用，精密度高。

綜上所述，本試驗成功制備了水包油(O/W)型伊曲康唑納米乳，制備工藝簡單、耗能低，含量測定方法精確有效，便于工業(yè)化生產(chǎn)，為臨床上伊曲康唑外用制劑新劑型的制備提供了理論依據(jù)。

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