土霉素固體脂質納米粒在家兔體內的藥代動力學研究

申 蕓，符華林，周 鳳，張 偉，舒 剛，唐 文，盧朝成

(四川農業(yè)大學 動物醫(yī)學院 藥學系，動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 雅安 625014)

土霉素(Oxytetracycline，OTC)是在土壤鏈霉菌(Streptomyces rimosus)的培養(yǎng)液中提取獲得的四環(huán)素類廣譜抗生素，對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、支原體、衣原體、立克次氏體等引起的感染有效，動物臨床上廣泛用于治療畜禽的痢疾、肺炎、尿路感染和腸道感染，也可用于原蟲引起的附紅細胞體病、弓形蟲病以及奶牛子宮內膜炎和乳房炎的治療[1]。但由于土霉素分子中含有酚羥基、烯醇結構而導致其性質不穩(wěn)定，內服吸收差，難以達到治療濃度，且易形成“肝腸循環(huán)”，增加肝臟毒性。土霉素注射液多以有機溶劑配制，其注射給藥時往往存在局部刺激性，順應性較差，這使得土霉素的臨床應用受到限制。為了改善土霉素普通制劑存在的問題，人們研制了土霉素聚乳酸微球[2]、鹽酸土霉素泡騰片[3]等，但多因工藝復雜、材料不易得而難以推廣。

固體脂質納米粒(Solid lipid nanoparticles,SLN)亦稱為固體脂質體，其研究始于20世紀90年代，是以三酰甘油、單硬脂酸甘油酯等脂質為載體材料，將藥物包裹或鑲嵌于類脂核中制成粒徑50～1 000 nm的固體脂質微粒給藥體系[4]。SLN主要用于包裹難溶性藥物，其具有物理化學性質穩(wěn)定、生物相容性好、可生物降解、緩釋、靶向性強、成本低和可大規(guī)模生產等優(yōu)點[5-7]，但獸醫(yī)臨床尚未有固體脂質納米粒的研究報道。

近年來，抗菌藥物的緩釋控釋制劑研究受到廣泛關注，特別對于時間依賴性抗生素，研究表明其體內藥物濃度大于最低抑菌濃度(MIC)的持續(xù)時間須超過給藥間期的40%～50%，抗菌活性才能到最大化[8]，因此開發(fā)其緩釋控釋制劑具有十分重要的臨床意義。土霉素屬于時間依賴性抗生素，其抑菌效果主要取決于其與細菌的接觸時間，因此研發(fā)土霉素固體脂質納米粒(Oxytetracycline solid lipid nanoparticles,OTC-SLN)不僅可以使土霉素緩慢釋放，延長其作用時間，提高生物利用度，而且由于納米粒獨特的滲透效應還有利于對細胞內感染的治療。本課題組研制了土霉素固體脂質納米粒，為了進一步明確固體脂質納米粒對土霉素在體內作用過程的影響，本試驗對其在家兔體內的藥代動力學進行了研究，并采用非房室數(shù)學模型統(tǒng)計矩方法計算了主要的藥代動力學參數(shù)，以期為臨床用藥及給藥方案的設計提供依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 藥品與試劑 土霉素對照品，河北圣雪大成制藥有限責任公司生產，含量99.05%；色譜甲醇、乙腈，天津科密歐化工試劑廠生產；土霉素注射液和土霉素固體脂質納米粒(OTC-SLN)為四川農業(yè)大學藥物制劑工程技術實驗室自制，其注射液符合中國獸藥典要求。其他試劑均為分析純級試劑。

1.1.2 主要儀器 島津SHIMADZU LC-2010C HT(CLASS-VP 6.13 multi)高效液相色譜系統(tǒng)(島津國際貿易上海有限公司)，XW-80A漩渦混合器(上海青浦滬西儀器廠)，高速冷凍離心機(美國科峻儀器公司)。

1.1.3 試驗動物 家兔10只，體質量(2.5±0.2) kg/只，由四川農業(yè)大學實驗動物中心提供，使用許可證號：scxk(川)-10-2006。

1.2 試驗設計

將10只家兔隨機分成2組，即土霉素注射液組和土霉素固體脂質納米粒組。試驗前用專用飼料飼養(yǎng)7 d，給藥前采血作為空白對照，之后2組均采取腹腔注射的方法給藥，給藥劑量均相當于土霉素原藥20 mg/kg。給藥后，分別于0.083，0.25，0.5，1，2，4，6，8，12，24，36，48，60，72，84和96 h采取每只家兔耳緣靜脈血1 mL，加入肝素鈉抗凝， 4 000 r/min 離心15 min，取上層血漿，置于-20 ℃冰箱中保存。

1.3 血漿樣品中土霉素質量濃度測定方法的建立

1.3.1 HPLC色譜條件 色譜柱：KromasilC18柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm)；流動相：0.01 mol/mL草酸-乙晴(V(草酸)∶V(乙腈)=89∶11)；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；紫外檢測波長：276 nm；進樣量：50 μL。

1.3.2 方法專屬性 取家兔空白對照血漿、加有土霉素的空白對照血漿樣品(土霉素含量100 μg/mL)、家兔腹腔注射土霉素注射液和土霉素固體脂質納米粒后的血漿樣品各500 μL，加入2.0 mL的EP管中，再分別加入體積分數(shù)20%高氯酸100 μL和甲醇400 μL，漩渦振蕩60 s混勻，13 000 r/min 離心5 min，吸取全部上清液于40 ℃水浴中氮氣吹干，殘余物加500 μL流動相溶解，13 000 r/min 離心3 min，取上清液經0.45 μm微孔濾膜過濾，進樣50 μL進行HPLC分析，記錄色譜圖，以考察血漿內源性物質對土霉素質量濃度的測定是否有干擾。

1.3.3 標準曲線的建立及最低檢測限的測定 精密稱取一定量土霉素對照品，加入0.01 mol/mL鹽酸溶解，配成質量濃度為500 μg/mL的標準儲備液，4 ℃保存?zhèn)溆?。分別移取儲備液適量于10 mL容量瓶中，用0.01 mol/mL鹽酸定容配成2.5，5，10，20，40，80，160和320 μg/mL的標準溶液。取空白對照血漿400 μL，分別加入不同質量濃度的土霉素標準溶液100 μL，使血漿土霉素標準質量濃度分別為0.5，1，2，4，8，16，32和64 μg/mL。各血漿標準溶液按1.3.2節(jié)方法處理，取上清液50 μL進樣，記錄色譜圖和峰面積。以土霉素質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得出回歸方程。用空白對照血漿制成低質量濃度的藥物樣品，經處理后測定，以引起3倍基線噪音(S/N=3)的藥物質量濃度為最低檢測限。

1.3.4 精密度和回收率試驗 將土霉素標準儲備液加入空白對照血漿中,制得土霉素質量濃度分別為1，8和32 μg/mL的高、中、低3個血樣，按照 1.3.2 節(jié)方法處理后進行HPLC測定，記錄色譜圖和峰面積，根據標準曲線計算土霉素質量濃度，進行日內和日間精密度(RSD)試驗。同法制備土霉素高、中、低質量濃度樣品，不同質量濃度做5個重復,以標準曲線測得量與土霉素加入量的比值計算回收率。另外取數(shù)份家兔空白對照血漿，每份400 μL，分別精密加入1，8和32 μg/mL 3種質量濃度的土霉素標準液，按照 1.3.2 節(jié)方法處理后進行HPLC分析，并與生理鹽水稀釋的高、中、低樣品的峰面積進行比較，計算提取回收率。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗 同法配制低、中、高3個質量濃度的土霉素血漿樣品各1份，按照1.3.2節(jié)方法處理后，分別于0，3，6和9 h進行HPLC分析，根據標準曲線計算土霉素質量濃度，考察土霉素的穩(wěn)定性。

1.4 血漿樣品中土霉素質量濃度的測定

參考文獻[9]處理血漿樣品。取出冷凍保存的血漿樣品，室溫下自然解凍，準確吸取500 μL血漿樣品于2.0 mL的EP管中，然后按照1.3.2節(jié)方法處理后進行HPLC分析，記錄色譜圖和峰面積進行定量分析，根據標準曲線計算出血樣中土霉素的質量濃度。

1.5 數(shù)據處理

試驗數(shù)據采用DAS3.1.0藥動學軟件進行處理，根據非房室模型的統(tǒng)計矩計算藥物腹腔注射后的藥代動力學參數(shù)[10]。根據測得的血藥濃度和計算的相關藥代動力學參數(shù)，用SPSS 17.0單因素ANOVA法分析各藥代動力學參數(shù)的差異性。

2 結果與分析

2.1 家兔血漿中土霉素HPLC測定方法的建立

在本試驗條件下，家兔空白對照血漿、加有土霉素的空白對照血漿樣品、家兔腹腔注射土霉素注射液和土霉素固體脂質納米粒后血漿樣品的HPLC結果見圖1和圖2。由圖2可知，土霉素保留時間為13 min左右，血漿峰與土霉素峰分離完全，血漿內源性雜質對土霉素含量的測定無干擾。以土霉素質量濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)進行回歸分析，得到標準曲線回歸方程為：y=61 142.1x-3 051.4，R2=0.998 8，說明在土霉素質量濃度為0.5～64 μg/mL時，土霉素質量濃度與峰面積線性關系良好。血漿中土霉素的最低檢測限為0.15 μg/mL。

圖 1 家兔空白對照血漿的HPLC色譜圖

圖 2 家兔血漿中土霉素的HPLC色譜圖

精密度試驗、回收率試驗和樣品穩(wěn)定性試驗結果見表1。由表1可知，日內、日間精密度的相對標準偏差均小于10%，回收率均在80%～120%，表明該檢測方法的準確度、精密度較高，血漿樣品在9 h內穩(wěn)定，重現(xiàn)性較好，可滿足生物樣品中土霉素測定的要求。

表 1 家兔血漿土霉素質量濃度HPLC檢測方法的精密度、回收率和血漿樣品穩(wěn)定性試驗結果(n=5)

2.2 血藥質量濃度測定結果及藥代動力學參數(shù)

家兔腹腔注射土霉素注射液和土霉素固體脂質納米粒后，2組家兔的血藥質量濃度見表2。根據2組試驗所得家兔血藥質量濃度數(shù)據，用DAS3.1.0進行智能化分析，以非房室模型的統(tǒng)計矩計算腹腔注射土霉素的藥代動力學參數(shù)，結果見表3。由表3可以看出，家兔腹腔注射土霉素注射液和土霉素固體脂質納米粒后，表觀分布容積(V1/F)分別為(9.581±0.301)和(3.676±0.258) L，土霉素固體脂質納米粒表觀分布容積更低，反映了血漿藥物質量濃度更高，因而土霉素制成納米粒后促進了藥物的吸收。測得血漿中土霉素吸收半衰期(T1/2Ka)分別為(18.570±0.851)和(27.871±1.767) h，說明土霉素固體脂質納米粒具有明顯的緩釋效應，吸收半衰期更長；血藥質量濃度達峰時間(Tmax)分別為1和4 h，達峰質量濃度(Cmax)分別為(3.676±0.376)和(3.699±0.562) mg/L，平均滯留時間(MRT(0-t))分別為(17.245±0.289)和(35.750±1.376) h。二者達峰質量濃度差異不大，但固體脂質納米粒的半衰期(T1/2)更長，清除率(CL/F)也更低，因而平均滯留時間顯著延長(P<0.05)，這對于時間依賴性的抗生素土霉素發(fā)揮其抗菌作用具有重要價值。藥時曲線下面積(AUC(0-t))分別為(60.766±2.974)和(153.563±8.390) mg/(L·h)；AUC(0-∞)分別為(83.955±3.720)和(170.15± 10.403) mg/(L·h)。由此說明，土霉素制成固體脂質納米粒后，其生物利用度也得到了顯著提高(P<0.01)。

表 2 土霉素注射液和土霉素固體脂質納米粒在家兔體內血藥質量濃度的比較(n=5)

3 討 論

固體脂質納米粒近年來備受藥劑學研究者的關注，其緩釋、靶向、穩(wěn)定的藥劑學性質使其應用越來越廣泛，而且其使用的載體材料單硬脂酸甘油酯性質穩(wěn)定，體內降解途徑固定，生物相容性好，細胞毒性低，可克服乳劑和脂質體的不穩(wěn)定問題。近年來,多種藥物的固體脂質納米粒相繼被報道，如氯諾昔康[11]、齊墩果酸[12]、胰島素[13]等，分別起到了緩釋、靶向、穩(wěn)定的作用。本研究利用單硬脂酸甘油脂制備了土霉素的固體脂質納米粒，也起到了緩釋長效的作用，達到了預期的研究目的，說明固體脂質納米粒也是一種很有前景的獸醫(yī)藥物新劑型。

文獻[14]報道采用四氫呋喃-0.025 mol/mL草酸(V(四氫呋喃)∶V(草酸)=15∶500)、0.2 mol/mL 草酸(pH 6.88)-乙腈(V(草酸)∶V(乙腈)=20∶80)、0. 01 mol/ L 磷酸二氫鈉溶液-乙腈(V(磷酸二氫鈉溶液)∶V(乙腈)=75∶25) 等作為流動相測定血漿中土霉素的質量濃度，但經預試驗發(fā)現(xiàn)，上述流動相條件并不適應本實驗室的HPLC系統(tǒng)，主要表現(xiàn)為土霉素出峰時間延后，峰形不規(guī)則以及拖尾等。最后經過多次預試驗篩選得到的色譜條件，土霉素出峰時間較合理，峰形良好，明顯與蛋白峰分離，也不受其他雜質干擾，靈敏度高。在處理血漿樣品時，曾對比甲醇和體積分數(shù)20%高氯酸不同比例混合后沉淀血漿蛋白的效果，結果表明，甲醇和體積分數(shù)20%高氯酸以體積比4∶1混合后沉淀蛋白的效果比較理想。本研究所建立的HPLC方法專屬性強，精密度、方法回收率及提取回收率均符合生物供試品分析的要求。

本試驗應用統(tǒng)計矩分析方法對2種土霉素制劑的藥代動力學參數(shù)進行了求算，這是根據藥物體內過程的隨機變量總體效應考慮的。當一定量的藥物進入體內后，具有相同化學結構的各個藥物分子在體內的轉運是一個隨機過程，存在一定概率。因此不需要對藥物設定專門的隔室，也不需要考慮藥物的房室模型特征，是一種對藥物在體內吸收、分布、代謝及排泄過程的研究方法。在給藥方式上，本研究最初擬以肌肉注射或者靜脈注射來考察土霉素納米粒的藥代動力學特征，但按照本研究制備的固體脂質納米粒的載藥量來換算劑量，給藥體積太大，因而選擇了給藥方便而且吸收也較快的腹腔注射來進行試驗。試驗結果證明，土霉素制成納米粒后進行家兔腹腔注射，盡管開始吸收速率較慢，但其AUC、MRT均明顯提高。研究表明，固體粒子攝取的主要途徑是細胞轉運、細胞間轉運及淋巴轉運，其中以淋巴轉運的速度最快，轉運的前提是藥物直接接觸或粘附在黏膜表面。本課題組以單硬脂酸甘油酯為載體制備的納米粒平均粒徑在100～350 nm，比表面積大，從而增加了納米粒與腹腔系膜的接觸面積，提高了腹腔系膜對粒子的攝取量。同時，本課題組制備的納米粒中用到了輔助乳化劑卵磷脂，其可促進脂質載體的淋巴吸收[15]，這在一定程度上增加了納米粒對腹腔黏膜的滲透性及生物粘附作用，使藥物的滯留時間延長，從而提高了粒子的攝取量，增加了藥物的生物利用度，增強了療效。

[參考文獻]

[1] 馬玉紅,史海燕.土霉素的研究概況 [J].青海畜牧獸醫(yī)雜志,2007,37(4):45-46.

Ma Y H,Shi H Y.Overview of oxytetracycline [J].Chinese Qinghai Journal of Animal and Veterinary Sciences,2007,37(4):45-46.(in Chinese)

[2] 李 良,李國明.W/O法制備鹽酸土霉素/聚乳酸微球及其釋藥性能 [J].中國現(xiàn)代應用藥學,2005,22(1):49-52.

Li L,Li G M.Preparation of oxytetracycline hydrochloride containing polylactic acid by water-in-oil and drug-relaeasing performance [J].Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy,2005,22(1):49-52.(in Chinese)

[3] 張 瑾. 鹽酸土霉素泡騰片的制備及其藥效學研究 [D].陜西楊凌：西北農林科技大學,2010.

Zhang J.Preparation of oxytetracycline hydrochloride sffervescent tablet and study on its pharmacodynamic [D].Yangling,Shaanxi:Northwest A&F University,2010.(in Chinese)

[4] 徐元龍,李學明,張 琪，等.固體脂質納米粒的研究新進展 [J].中國新藥雜志,2005,14(7)：838-843.

Xu Y L,Li X M,Zhang Q,et al.Advances in solid lipid nanoparticles [J].Chinese Journal of New Drugs,2005,14(7):838-843.(in Chinese)

[5] Harivardhan R L,Sharma R,Chuttani K,et al.Influence of administration route on tumor uptake and biodistribution of etoposide loaded solid lipid nanoparticles in Dalton’s lymphoma tumor bearing mice [J].Journal of Controlled Release,2005,105(3):185-198.

[6] Blasi P,Giovagnoli S,Schoubben A,et al.Solid lipid nanoparticles for targeted brain drug delivery [J].Advanced Drug Delivery Reviews,2007,59(6):454-477.

[7] 賀小玲,王東凱,李林穗.靜脈注射用固體脂質納米粒的應用前景分析 [J].中國藥劑學雜志,2009,7(2):52-58.

He X L,Wang D K,Li L S.Perspectives on the application of solid lipid nanoparticles for intravenous injection [J].Chinese Journal of Pharmaceutics,2009,7(2):52-58.(in Chinese)

[8] 劉學紅,郭瑞臣,黃明慧.抗菌藥物的藥代動力學和藥效學參數(shù)對臨床用藥的意義 [J].中國醫(yī)院藥學雜志,2006,25(2):154-155.

Liu X H,Guo R C,Huang M H.Clinical value of pharmacokinetic and pharmacodynamic parameters of antimicrobial drugs [J].Chinese Journal of Hospital Pharmacy,2006,25(2):154-155.(in Chinese)

[9] 畢秀麗,黃桂華,張 娜,等.替莫唑胺固體脂質納米粒在動物體內藥代動力學及組織分布研究 [J].中國藥學雜志,2008,42(21):1655-1660.

Bi X L,Huang G H,Zhang N,et al.Study on pharmacokinetics in rabbit and body distribution in mice of temozolomide solid lipid nanoparticles by intravenously injection [J].Chinese Pharmaceutical Journal,2008,42(21):1655-1660.(in Chinese)

[10] 劉建平,李 高.生物藥劑學與藥物動力學 [M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2011.

Liu J P,Li G.Biopharmaceutics and pharmacokinetics [M].Beijing:People’s Health Publishing House,2011.(in Chinese)

[11] 解 斐,張 棟,劉天華,等.氯諾昔康固體脂質納米粒的實驗研究 [J].山東大學學報:醫(yī)學版,2010,48(4):155-159.

Xie F,Zhang D,Liu T H,et al.Experiment on lornoxicam-loaded solid lipid nanoparticles [J].Journal of Shandong University:Health Sciences,2010,48(4):155-159.(in Chinese)

[12] 王婧雯.齊墩果酸固體脂質納米粒肝靶向性及藥效學研究 [D].西安：第四軍醫(yī)大學,2007.

Wang J W.Study of liver targeted characteristics and pharmacodynamic role of oleanolic acid solid lipid nanoparticles [D].Xi’an:Fourth Military Medical University,2007.(in Chinese)

[13] 張繼明,胡富強,應曉英,等.胰島素固體脂質納米粒的制備及其理化性質研究 [J].中國藥學雜志,2004,39(8):605-634.

Zhang J M,Hu F Q,Ying X Y,et al.Studies on insulin-loaded stearylamine nanoparticles: preparation and physicochemical properties [J].Chinese Pharmaceutical Journal,2004,39(8):605-634.(in Chinese)

[14] 蔡金華，顧 欣，劉雅妮.長效土霉素注射液在豬體內的藥代動力學研究 [J].中國獸藥雜志,2006,40(7):17-21.

Cai J H,Gu X,Liu Y N.Study on pharmacokinetics of long-action oxytetracycline injection in swine [J].Chinese Journal of Veterinary Drug,2006,40(7):17-21.(in Chinese)

[15] Holm R,Mullertz A,Christensen E,et al.Comparison of total oral bioavailability and the lymphatic transport of halofantrine from three different unsaturated triglycerides in lymph-cannulated conscious rats [J].European Journal of Pharmaceutical Sciences,2001,14(4):331-337.