1株抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌放線菌的鑒定及其代謝產物活性分析

楊 靜，易麟乙，劉 美，王劉慶，廖美德

(華南農業(yè)大學 天然農藥與化學生物學教育部重點實驗室，廣東 廣州 510642)

自1961年英國Jevons發(fā)現(xiàn)首例耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)以來[1]，在歐美及亞洲相繼出現(xiàn)有關MRSA所致的感染，到20世紀80年代，MRSA感染幾乎遍及全球，成為臨床上最常見的病原菌之一。近年來,MRSA感染疾病的流行病學發(fā)生了顯著變化，由最初的醫(yī)院獲得性感染發(fā)展為社區(qū)獲得性感染，自Saravolatz等[2]首次報道社區(qū)獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(community-acquired MRSA，CA-MRSA)感染后，CA-MRSA感染病例在全球陸續(xù)被報道，MRSA對人類健康的威脅日益嚴重。最近的研究結果表明，MRSA 一般具有多重耐藥特征， 臨床已經分離到對萬古霉素耐藥的菌株(VRSA)[3]，從長期與患乳腺炎奶牛接觸的工作人員體內分離得到了相同的MRSA菌株，表明MRSA 可能在人與動物之間相互傳播[4]。MRSA已經成為臨床抗菌感染治療的首要難題，并與乙型肝炎、艾滋病一起被稱為當今世界三大感染頑疾[5]，因此，研發(fā)新型抗MRSA藥物刻不容緩。

本項目組前期從原始森林土壤中分離、篩選得到1株放線菌菌株，本研究對其形態(tài)特征、生理生化特征、分類地位及其代謝產物的作用范圍和抗菌活性物質的部分特性等進行了探討，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌株由廣州醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科贈送。

1.2 放線菌AF1菌株的分離與純化

將從非洲原始森林收集的土壤樣品系列稀釋后，涂布在高氏1號培養(yǎng)基上。28 ℃培養(yǎng)10 d后挑取所有單菌落進行2次純化，分離篩選到目標菌株，將其命名為AF1菌株。

1.3 培養(yǎng)基

所用的培養(yǎng)基有高氏1號培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、瓊脂培養(yǎng)基(ISP1)、胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(ISP2)、甘油d門冬素瓊脂培養(yǎng)基(ISP3)、L-酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基(ISP4)、察氏培養(yǎng)基(ISP5)、伊莫松培養(yǎng)基(ISP6)和瓦氏肉汁培養(yǎng)基(ISP7)，7種ISP培養(yǎng)基的配方參見文獻[6-7]。

1.4 AF1菌株的培養(yǎng)、發(fā)酵及其乙酸乙酯粗提物的制備

將AF1菌株接種到高氏1號固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)10 d，取分生孢子制備孢子懸液，接種到裝有高氏1號液體培養(yǎng)基的錐形瓶(150 mL/500 mL)中，于28 ℃、160 r/min搖瓶培養(yǎng)7 d，然后8 000 r/min 離心20 min，取上清液用雙層濾紙過濾得發(fā)酵液。濾液用乙酸乙酯萃取3次，收集萃取液，減壓蒸餾濃縮可得到發(fā)酵液的乙酸乙酯粗提物。

1.5 AF1菌株的鑒定

1.5.1 形態(tài)觀察 在高氏1號培養(yǎng)基平板上鋪單層透析袋膜，接種培養(yǎng)AF1孢子，培養(yǎng)10 d待分生孢子形成后，剪取透析袋膜粘臺，經超臨界干燥、噴鍍后，用掃描電子顯微鏡觀察菌絲和孢子形態(tài)[6]。

1.5.2 培養(yǎng)特征 按參考文獻[7-8]的方法，將AF1菌株孢子分別接種到ISP1、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、ISP6和ISP7培養(yǎng)基上，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d，觀察記錄其培養(yǎng)特征，按ISCC COLOR CHARTS色譜記錄菌落顏色[9]。

1.5.3 生理生化特性 參照《鏈霉菌鑒定手冊》[10]中的方法，測定AF1菌株的明膠液化、牛奶凝固和胨化、硫化氫產生、纖維素及碳源利用等生理生化特征。

1.5.4 16S rRNA序列分析及其系統(tǒng)發(fā)育分析 參照文獻[11]的方法提取AF1菌株基因組DNA。PCR擴增采用通用引物F： 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′。PCR 反應體系總體積25 μL，其中包括10×Buffer 2.5 μL，dNTP 0.2 μL，MgCl22.2 μL，Primer F 2 μL，Primer R 2 μL，Taq酶0.3 μL(3 U/μL),DNA 模板1.0 μL，ddH2O 14.8 μL。反應程序為： 94 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共33個循環(huán)；循環(huán)結束后，72 ℃再后延3 min。將PCR 產物送上海生工生物工程技術服務公司測序，測序結果用BLAST軟件和Mega5.0[12]構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 AF1菌株代謝產物的生物活性

1.6.1 發(fā)酵液的穩(wěn)定性 (1)熱穩(wěn)定性。參照文獻[13]，將待測發(fā)酵產物分別置于30(室溫)，50，70，80，90，100 ℃條件下水浴，水浴時間設30和60 min 2個處理，待降至室溫后，分別取處理后的發(fā)酵液20 μL，采用瓊脂平板打孔法(孔徑為6 mm)[14]測定其對MRSA的抑菌活性，重復3次。以室溫下放置的發(fā)酵液作為對照。相對抑菌活性計算公式為：

相對抑菌活性=(處理組抑菌圈直徑-6 mm)/(對照組抑菌圈直徑-6 mm)×100%。

(2)酸堿穩(wěn)定性。用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl將發(fā)酵液pH值分別調節(jié)至2.5，3.5，5.5，6.5，7.3，8.9，9.8和10.2；常溫靜置30 min后，用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl溶液調節(jié)發(fā)酵液pH至7.3；取處理后的發(fā)酵液20 μL，采用瓊脂平板打孔法測定其對MRSA的抑菌活性，重復3次。以發(fā)酵液作為對照，計算相對抑菌活性。

(3)對紫外線照射的穩(wěn)定性。取10 mL發(fā)酵液5份，置于波長254 nm、功率30 W的紫外燈下20 cm處[15]，照射時間為 20，30，40，50和60 min；分別取處理后的發(fā)酵液20 μL，采用瓊脂平板打孔法測定對MRSA的抑菌活性，重復3次。以發(fā)酵液作為對照，計算相對抑菌活性。

1.6.2 代謝產物萃取溶劑的選擇 將AF1菌株接種到高氏1號培養(yǎng)基上，置于29 ℃、160 r/min的搖床上進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d后用雙層濾紙過濾，濾液分別用等體積的三氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、正丁醇在分液漏斗中進行萃取。上下顛蕩10次，靜置萃取20 min。分別取上、下層進行抑菌活性測定。

1.6.3 代謝產物的溶解性 將發(fā)酵液的乙酸乙酯粗提物溶于丙酮中，等體積分成15份，待丙酮揮發(fā)完全后，分別用2 mL的水、甲醇、乙醇、丙酮充分溶解，每處理重復3次。取處理后的發(fā)酵液20 μL，采用瓊脂平板打孔法測定其對MRSA的抑菌活性。

1.7 AF1菌株發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物對MRSA的最低抑菌質量濃度(MIC)

采用微量肉湯稀釋法，測定AF1菌株發(fā)酵產物對MRSA的MIC[16]。將AF1菌株發(fā)酵液的乙酸乙酯粗提物用丙酮溶解制成質量濃度為1 088 μg/mL 的抗菌藥物。將MRSA在LB瓊脂板上活化，然后接種在LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h，作為指示菌。取無菌試管(12 mm×100 mm)12支，每管加1 mL LB培養(yǎng)基，在第1管中加入抗菌藥物原液(1 088 μg/mL)1 mL混勻，按倍比稀釋法依次稀釋。然后在每管中加入制備好的MRSA接種物各1 mL。第1管至第11管藥物質量濃度分別為544，272，136，68，34，17，8.5，4.25，2.125，1.06和0.53 μg/mL，每個梯度重復3次。將混合液置于溫度30 ℃、轉速160 r/min的搖床上培養(yǎng)5 h后，以未添加粗提物的培養(yǎng)管作為對照，測定MRSA培養(yǎng)液的吸光度(OD600)，根據(jù)NCCL有關規(guī)定[17](后文列出)，計算活性物質的MIC值。按上述方式測試相同體積丙酮對MRSA生長的抑制作用。

2 結果與分析

2.1 AF1菌株的分類鑒定

2.1.1 菌株形態(tài)和培養(yǎng)特征 圖1-A顯示，放線菌AF1在高氏1號培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后，菌落表面呈淺灰色，有脊狀褶皺，能產生棕紅色可溶性色素；分生孢子絲直或呈波浪彎曲狀，孢子成鏈呈松散螺旋狀，不形成分生孢子包囊，分生孢子大小1.5 μm×0.45 μm，呈柱形，表面光滑(圖1-B，C，D)。

AF1菌株在7種ISP培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后，其特征觀察結果見表1。由表1可以看出，AF1菌株在ISP1、ISP4和ISP5培養(yǎng)基上生長較慢，在其他4種培養(yǎng)基上生長良好，后期菌落邊緣有輪紋現(xiàn)象；在7種培養(yǎng)基上均能產可溶性色素，其中在ISP1、ISP3和ISP5上為棕紅色色素， 在ISP4和ISP7上為灰色色素，在ISP2、ISP6上分別為淺褐色和銀灰色色素。

2.1.2 生理生化特性 AF1菌株的生理生化特性測定結果見表2。由表2可見，AF1菌株能利用葡萄糖、D-半乳糖、麥芽糖、鼠李糖和蔗糖，不能利用D-果糖、D-甘露醇和肌醇；能水解淀粉，但不能水解纖維素；在明膠液化、黑色素、牛奶凝固、產硫化氫及硝酸鹽還原酶等試驗中均呈陽性。

2.2 AF1菌株的16S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析

測得AF1菌株的16S rDNA全長為1 242 bp，全序列已在GenBank中登記，登錄號為KF059834.1。BLAST軟件比對結果顯示，AF1菌株與GenBank中加利利鏈霉菌XSD-102(StreptomycesgalileeXSD-102)菌株的同源率為100%，與StreptomycesboliliHBUM174851和Streptomycessp.SX-4的相似性均為99%。用Mega5.0軟件構建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)顯示，AF1與上述3種菌株的進化距離最近。

圖 1 菌株AF1的形態(tài)特征

表 1 AF1菌株在7種ISP培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征

表 2 AF1菌株的生理生化特性

圖 2 AF1菌株16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 AF1菌株代謝產物的穩(wěn)定性

2.3.1 熱穩(wěn)定性 AF1發(fā)酵液中活性物質的熱穩(wěn)定性測定結果見圖3。

圖 3 AF1菌株抑菌活性物質的熱穩(wěn)定性

由圖3可知，在30～80 ℃下，AF1菌株代謝產物生物活性降低不明顯，隨著處理時間的延長，活性略有降低。90和100 ℃時生物活性明顯下降，90 ℃處理60 min和100 ℃條件下活性幾乎消失。

2.3.2 酸堿穩(wěn)定性 不同pH處理條件下，AF1發(fā)酵液中物質的抑菌活性測定結果見圖4。圖4表明，在試驗pH范圍內，pH值對發(fā)酵液中物質的抑菌活性影響不明顯，抑菌活性保持穩(wěn)定。但隨著pH值的改變，發(fā)酵液的顏色變化較大，在酸性條件下呈橘黃色，并逐漸過渡到棕紅色。

2.3.3 對紫外線照射的穩(wěn)定性 AF1發(fā)酵液對紫外線照射的穩(wěn)定性測定結果見圖5。圖5表明，AF1發(fā)酵液經紫外線照射不同時間后，其生物活性有一定的降低但不明顯，說明其抗菌活性物質具有一定的紫外線耐受性。

圖 4 pH對AF1菌株發(fā)酵液中抑菌活性物質穩(wěn)定性的影響

2.4 AF1菌株抑菌活性物質萃取溶劑的選擇

由表3可見，在原始pH 條件下，AF1菌株發(fā)酵液中的生物活性物質大部分能被乙酸乙酯和正丁醇萃取，三氯四烷萃取效果相對較弱，石油醚幾乎不能萃取。

表 3 有機溶劑對AF1菌株發(fā)酵液活性物質的萃取效果

2.5 AF1菌株發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物中活性物質的溶解性

由表4可知，AF1菌株發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物中抗菌活性物質在丙酮和甲醇溶液中的溶解度較高，根據(jù)相似相溶原理，可初步判斷AF1菌株發(fā)酵液中抗菌活性物質是一種中高度極性的物質。

表 4 有機溶劑對AF1菌株發(fā)酵液活性物質的溶解性

2.6 AF1菌株發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物對MRSA 的MIC

AF1菌株發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物對MRSA的抑菌率見圖6。

圖 6 AF1菌株發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物對MRSA的抑菌率

由圖6可以看出，用質量濃度≥272 μg/mL的AF1菌株發(fā)酵液的乙酸乙酯粗提物處理MRSA時，菌株不再生長。當粗提物質量濃度在34～136 μg/mL 時，隨著質量濃度提高，MRSA菌體生長受到明顯抑制。粗提物質量濃度低于34 μg/mL時，菌體生長抑制不明顯。參照NCCL[17]的規(guī)定，與陽性生長對照管比較，可以抑制80%細菌生長的藥物質量濃度為受試菌的MIC。因此，AF1菌株發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物對MRSA 的最小抑菌質量濃度為68 μg/mL。

3 討 論

本研究分析結果表明，AF1菌株與加利利鏈霉菌XSD-102 16S rDNA序列的同源性達100%，故將AF1菌株暫定名為加利利鏈霉菌(S.galilaeusAF1)。現(xiàn)有資料表明，S.galilaeus為馬鈴薯瘡痂病(Potato common scab)病原菌，張萌等[18]分析了中國不同地區(qū)的馬鈴薯瘡痂病病原菌發(fā)現(xiàn)，病原菌的分布具有種特異性和分布多樣性。Oki等[19]在S.galilaeusMA144-M1中發(fā)現(xiàn)了阿克拉霉素A和B(Aclacinomycin A and B)以及其他19種類似物，阿克拉霉素作為抗癌藥物,因其較低的心臟毒性而獲得極大關注[20]。范瑾[21]也從四川省的土壤中分離到1株產生蒽環(huán)類抗腫瘤抗菌素的鏈霉菌77-3082 。另有報道發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)7 d后的加利利鏈霉菌菌絲體中發(fā)現(xiàn)了阿柔比星(Aclarubicin)[22-23]，但未見有關其抑菌活性物質的研究報道。

MRSA對人類健康的威脅日益嚴重，目前用于治療相關感染的藥物有利奈唑烷(linezolid)[24]、達托霉素(daptomycein)[25]、泰利霉素(tigecycline)、替加環(huán)素(tigecycline)[26]等，還有一批處于臨床研究階段的藥物如頭孢吡普、達巴萬星等。但是在新藥研發(fā)過程中抗性菌也不斷產生，且新藥的研制速度不及耐藥菌的產生速度，因此尋求作用方式新穎、不易產生耐藥性的新品種迫在眉睫。本研究發(fā)現(xiàn)，AF1菌株發(fā)酵液及其乙酸乙酯粗提物具有良好的抗細菌活性，且只對革蘭氏陽性菌敏感(將另文報道)，能有效殺滅耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。

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