棉花三元雜種的細胞遺傳學研究

張鹿飛，陳弟， 吳玉香

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，山西 太谷 030801;2.中國農(nóng)業(yè)科學院 棉花研究所，河南 安陽 455000)

棉屬(Gossypium)為被子植物錦葵目(Malvales)、錦葵科(Malvaleae)、棉族(Gossypiceae)。最新提出的棉屬分類系統(tǒng)為4個亞屬，共51種(亞種)[1]，其中包括46個二倍體種(2n=2x=26)和5個四倍體棉種(2n=4x=52)，即陸地棉(G.hirsutum)、海島棉(G.barbadense)、毛棉(G.tomentosum)、黃褐棉(G.mustelinum)、達爾文棉(G.darwinii)，四倍體棉種是由二倍體A、D組棉種雜交后加倍形成的。

種質(zhì)資源是棉花育種的重要基礎。棉屬野生種具有抗病蟲，耐干旱、鹽堿和纖維品質(zhì)優(yōu)異等特性。遠緣雜交是人工合成新種與新種質(zhì)的重要手段，長期以來棉花育種家做了大量的嘗試并取得了較大的進展，大量的遠緣雜交研究通過探索把不同物種的有益性狀進行重新組合，以期創(chuàng)造出近緣雜交無法得到的優(yōu)異特性，為棉花新種質(zhì)的創(chuàng)造提供了新的途徑[2]。龐朝友等[3]收集了155份棉屬種間雜交漸滲系，對主要農(nóng)藝性狀的鑒定結(jié)果表明，不同野生種在陸地棉優(yōu)質(zhì)纖維、抗病、抗逆和抗蟲種質(zhì)改良上發(fā)揮了不同的作用。澳洲棉原產(chǎn)澳洲西部，分布于Carpentar灣海岸和昆士蘭的山中[4]，為C3染色體組的二倍體野生棉。Fryxell[5]發(fā)現(xiàn)其具有種子無腺體、植株有腺體的特性，抗或耐棉蚜、紅蜘蛛，抗干旱，具有提高衣分及纖維成熟度的潛力[6]。黃褐棉原產(chǎn)南美洲，分布于巴西東北部，為異源四倍體野生棉，黃褐棉在3個野生四倍體棉種中與陸地棉距離最遠[7]，因此最有可能存在一些新的基因位點，可以用于陸地棉的遺傳改良。顧本康等[8]初步鑒定結(jié)果表明，澳洲棉、黃褐棉對黃萎病均表現(xiàn)免疫。

本研究試圖通過遠緣雜交將野生澳洲棉和黃褐棉的優(yōu)良性狀導入陸地棉，用來改良栽培種陸地棉，并通過雜種減數(shù)分裂行為來探討其育性，以期尋求育性恢復的有效方法，為棉花遺傳育種及新種質(zhì)創(chuàng)新提供理論依據(jù)和中間材料。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

陸地棉(G.hirsutum)(2n=4x=52)，C組野生澳洲棉(G.australe)(2n=2x=26)，AD組野生黃褐棉(G.mustelinum)(2n=4x=52),均取材于國家種質(zhì)三亞野生棉圃。

表1 供試材料及其地理分布

三元雜種合成過程：

1.2 三元雜種F1的減數(shù)分裂觀察

1.2.1 取材與固定

棉花長出花蕾后，用鑷子于不同時間(8:00、8:30、9:00)采集正在生長的不同大小的花蕾，并將花蕾放入盛有卡諾固定液的廣口瓶中，固定液種類很多，常用的是卡諾固定液，其配方為95%酒精和冰乙酸(3∶1)，隨配隨用。固定時間12～24 h，固定后用70%的酒精保存，置于4℃冰箱冷藏待用。

1.2.2 制片

將花蕾從廣口瓶中取出，放于干凈的濾紙上，用鑷子和解剖針輕輕將花蕾撕開；取其中4～7?；ㄋ帲诺角逑锤蓛舻妮d玻片上，加一滴卡寶品紅后,用鑷子輕輕擠壓，以使花藥中的花粉母細胞游離出來。用鑷子垂直將載玻片上肉眼可見的雜質(zhì)去掉，取一蓋玻片輕輕蓋上。在酒精燈上方烘烤(以不沸騰為限)，然后立即用濾紙卡住，用大拇指垂直重壓。

1.2.3 鏡檢

用OLYMPUS DP71顯微鏡觀察花粉母細胞減數(shù)分裂行為，將視野中好的分裂相進行照相并封片保存，備用。

1.2.4 統(tǒng)計分析

花粉粒的觀察與統(tǒng)計：選200個視野進行觀察，記錄雜種花粉粒中正常與異?；ǚ哿５臄?shù)目，分別計算其比率。

小孢子形態(tài)特征的觀察：分別選取100個視野，記錄不同孢子的形態(tài)及數(shù)目，并計算比率。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉粒的觀察與統(tǒng)計

正?；ǚ哿ｏ枬M，形態(tài)大小一致，如親本二倍體澳洲棉花粉粒；三元雜種花粉粒形狀不規(guī)則，且大小不等，有的形狀飽滿，但沒有生活力，花粉粒棘狀物小，短而粗(圖1-A)，也存在不完整的破裂花粉粒。對200個視野中的1189個花粉粒的統(tǒng)計結(jié)果(表2)表明，三元雜種正常的花粉粒只占46.1%，具有生活力的花粉粒更少，大部分為異?；ǚ哿！＿@是三元雜種不育的主要原因。

2.2 小孢子發(fā)育期及分裂后期的觀察

三元雜種的花粉母細胞，在減數(shù)分裂后期Ⅱ染色體向多極移動(圖1-B、C),從而形成多分孢子，在統(tǒng)計的100個視野的322個多分孢子中，大多出現(xiàn)微核，每個母細胞中微核數(shù)目在1～5不等，五分體大多是4大1小，六分體大多是4大2小(圖1-D)。

表2三元雜種花粉粒類型統(tǒng)計

Table2 Statistic analysis of pollen type for trispecific hybrid

類型Type數(shù)量Number百分比Percentage/%正常54846.1不正常64153.9花粉?？倲?shù)1189100

三元雜種與親本的多分孢子統(tǒng)計見表3，親本澳洲棉正常四分體占59.5%；黃褐棉正常四分孢子占65.5%；三元雜種中大部分為六分體(48.7%)，正常四分孢子僅占8.4%，且多數(shù)四分孢子含微核，出現(xiàn)5～8個不等的多分孢子(圖1-E、F)，且平均孢子數(shù)為5.87。

圖1 三元雜種的減數(shù)分裂行為Fig.1 Meiosis behavior of trispecific hybrid注：A為三元雜種不規(guī)則花粉粒；B和C為三元雜種減數(shù)分裂后期Ⅱ染色體向多極移動；D～F為三元雜種多分孢子Note:A:abnormal pollen grain of trispecific hybrid;B and C:chromosome segregation to different directions at anaphase II in meiosis;D～F:multispores of trispecific hybrid.

材料Materials類型Type2Two3Three4Four5Five6Six7Seven8Eight9Nine10Ten11Eleven總計Total異源六倍體數(shù)量151994181200000158頻率/%9.51259.511.47.600000100小孢子總數(shù)3057376907200000625黃褐棉數(shù)量00108391350000165頻率/%0065.523.67.930000100小孢子總數(shù)0043219578210000726F1雜種數(shù)量18027251578213000322頻率/%5.608.47.848.725.54000100小孢子總數(shù)3601081259425741040001889

3 結(jié)論與討論

三元雜種F1是由陸地棉、澳洲棉、黃褐棉3種棉種種間雜交而成，觀察三元雜種的小孢子發(fā)育時期發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)了不同程度的微核和后期不同步分離，降低了遠緣雜種的育性，因此，需要對F1進行強制自交或大量回交等方法使其恢復育性。目前已有這些方面的報道，如張伯靜等[9]在亞洲棉、比克氏棉和陸地棉異源四倍體的研究時，先將亞洲棉和比克氏棉雜種染色體加倍，恢復其育性，再和陸地棉雜交，但得到的三元雜種F1不育，通過大量回交及組織培養(yǎng)后，培育出可育的雜種后代，又通過株系間修飾雜交最終得到穩(wěn)定的種質(zhì)系；高燕會等[10]利用強制自交使四元雜種的育性部分恢復；此外，吳玉香等[11]利用活體保存對栽培棉種間四元雜種育性和染色體構(gòu)型的影響研究中證明，延長種間雜種植株的生長時間有利于協(xié)調(diào)不同來源的染色體組之間的關系，使染色體組趨于平衡，育性得到大幅度恢復。由于種間三元雜種是3個不同的棉種合成的，包含3個染色體組(A、D、C)，其中A、D染色體組和C染色體組的親緣關系較遠，其染色體同源性很低，因此花粉母細胞在減數(shù)分裂中期大多數(shù)染色體不能配對成二價體，未配對的單價體在減數(shù)分裂第一次分裂后期向兩極隨機分離，或丟失，或形成微核，最終導致不能形成正常的四分孢子，而形成多分孢子，導致花粉粒沒有生活力，這是三元雜種不育的主要原因。

通過遠緣雜交新獲得的遠緣雜種類型只是育種的基礎材料，仍需再進行雜交、回交和選擇，以恢復其育性，并保持和提高目標性狀及主要經(jīng)濟性狀的選擇，選育出生產(chǎn)上能夠利用的類型。

參 考 文 獻

[1]Fryxell P A. A revised taxonomic interpretation ofGossypiumL.(Malvaceae)[J].Pheedea,1992, 2(2): 108-165.

[2]梁正蘭. 棉花遠緣雜交[M].北京:科學出版社,1999:1-2.

[3]龐朝友，杜雄明，馬峙英.棉花種間雜交漸滲系創(chuàng)新效果評價及特異種質(zhì)篩選[J].科學通報,2006,51(1):55-62.

[4]Valicek P.李賢柱,吳敬音,譯.野生棉與栽培棉[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1978:39-40.

[5]Fryxell P A. A reviation of the Australian species ofGossypiumwith observations on the occurrence ofThespesiain Australia (Malvacea)[J].Aust J Bot,1965,13:71-102.

[6]Ndungo V,Demol J,Maréchal R.L'amélioration du cotonnierGossypiumhirsutumL. par hybridation interspécifique[J].Bull Rech Agron Gembloux,1988,23(1):27-49.

[7]Wendel J F,Cronn R C.Polyploidy and the evolutionary history of cotton[J].Adv Agron,2003,78:139-186.

[8]顧本康，李經(jīng)儀，顧萍，等.棉屬野生種枯萎病、黃奏病抗性鑒定初報[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,1993(5):36-37.

[9]張伯靜，李炳林，祝水金，等.亞洲棉、比克氏棉和陸地棉異源四倍體的合成[J].棉花學報,1993,5(1):15-20.

[10]高燕會,祝水金,季道藩.四種栽培棉合成的四元雜種F1細胞遺傳學研究[J].棉花學報,2003,15(5):259-263.

[11]吳玉香,陳崇乾,高燕會,等.活體保存對栽培棉種間四元雜種育性和染色體構(gòu)型的影響[J].棉花學報,2007,19(6):461-466.