植物鞘氨醇-1-磷酸對暗誘導(dǎo)蠶豆氣孔關(guān)閉及保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)pH和NO的影響

馬引利,佘小平,閆 閱

(1 山西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041004；2 陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062)

鞘脂是一類在許多真核生物的膜結(jié)構(gòu)和機(jī)能中起重要作用、且普遍存在的膜脂。成熟鞘脂由1分子脂肪酸與1分子帶有一個(gè)極性基團(tuán)的長鏈堿基(LCB)以酰胺鍵結(jié)合而成[1]。哺乳動物中的LCB主要是鞘氨醇；而植物中的LCB有9種，主要是4,8-二烯醇和4-羥基-8-(神經(jīng))鞘氨醇的同分異構(gòu)體，如植物鞘氨醇(Phyto-Sph)和二氫(神經(jīng))鞘氨醇[1]。LCBs的磷酸化是具有生物活性的鞘脂代謝物產(chǎn)生的一個(gè)重要過程。在真核生物中，LCBs由ATP依賴的LCB激酶(LCBKs)催化生成LCB-1P[2]，LCB-1P(如鞘氨醇-1-磷酸和植物鞘氨醇-1-磷酸)參與調(diào)節(jié)植物的許多重要的生理過程[3-8]。植物鞘氨醇-1-磷酸(Phyto-S1P)是植物中一種主要的、Δ4飽和的LCBP(C-4和C-5之間無雙鍵)，由鞘氨醇激酶(SphK)催化Phyto-Sph生成。前人的研究結(jié)果證明，Phyto-S1P是擬南芥保衛(wèi)細(xì)胞脫落酸(ABA)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要信號分子[5-7]。ABA處理可顯著提高擬南芥野生型SphK(一種LCBK)的活性，且Phyto-S1P介導(dǎo)ABA調(diào)控的氣孔關(guān)閉；以擬南芥異三聚體G蛋白a 亞基基因GPA1敲除突變體為材料的研究顯示，Phyto-S1P促進(jìn)氣孔關(guān)閉和抑制氣孔開放的效應(yīng)被阻斷，這一結(jié)果表明，與在動物中一樣，異三聚體G蛋白也是植物Phyto-S1P的下游靶分子[5]。鞘氨醇激酶1(SPHK1)已被證明參與ABA依賴的保衛(wèi)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和種子萌發(fā)過程[6]。Guo等[7]報(bào)道，磷脂酶Dα1(PLDα1)/磷脂酸(PA)和SPHK/Phyto-S1P相互作用共同參與ABA調(diào)控的擬南芥氣孔關(guān)閉。

胞內(nèi)pH變化在植物許多生理過程中起重要作用[9-12]。胞質(zhì)pH變化與氣孔運(yùn)動調(diào)節(jié)密切相關(guān)。保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)堿化介導(dǎo)ABA和茉莉酸甲酯(MJ)誘導(dǎo)的擬南芥、豌豆和兜蘭的氣孔關(guān)閉[9,12-14]。ABA可以提高兜蘭保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)中游離Ca2+([Ca2+]cyt)的濃度，誘導(dǎo)胞質(zhì)堿化[9]。胞質(zhì)堿化與胞質(zhì)Ca2+振蕩在擬南芥保衛(wèi)細(xì)胞ABA與MJ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中協(xié)調(diào)發(fā)揮作用[15]。胞質(zhì)堿化也可激活蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞外向K+電流，鈍化內(nèi)向K+電流，從而促進(jìn)K+凈流出[16]。另外，保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)酸化可介導(dǎo)激動素、吲哚乙酸(IAA)和殼梭孢素(FC)誘導(dǎo)的氣孔開放[9]，并激活內(nèi)向K+電流[17]。

一氧化氮(NO)作為一種普遍存在于生物體內(nèi)的胞內(nèi)和胞間信號分子，參與著多種生理過程[18]。Garcia-Mata等[19]首次證實(shí)，NO和氣孔運(yùn)動有關(guān)，外源NO能誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉；內(nèi)源NO作為一種中間信號分子，在保衛(wèi)細(xì)胞ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮作用[20]。另外，有研究顯示，NO介導(dǎo)水楊酸[21]、暗條件[22]、UV-B[23]等調(diào)控的氣孔運(yùn)動。

目前，尚不清楚Phyto-S1P是否介導(dǎo)其他內(nèi)、外因素，如暗條件對氣孔關(guān)閉的影響，也未見關(guān)于Phyto-S1P是否參與暗誘導(dǎo)蠶豆氣孔關(guān)閉的報(bào)道。為此，本研究借助氣孔試驗(yàn)，利用基于NO特異熒光探針和pH特異熒光探針的激光共聚焦顯微技術(shù)，對Phyto-S1P在暗誘導(dǎo)蠶豆氣孔關(guān)閉中的作用及其與保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)堿化和NO產(chǎn)生的關(guān)系進(jìn)行研究，旨在進(jìn)一步了解Phyto-S1P在暗誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉中的作用及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，也為完善暗調(diào)控氣孔運(yùn)動的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑積累資料。

1 材料與方法

1.1 試 劑

植物鞘氨醇-1-磷酸(Phyto-S1P)，購自Avanti Polar Lipids 公司；N,N-二甲基鞘氨醇(DMS)，購自Merk(Germany)公司；NO特異熒光探針(DAF-2 DA)、pH特異熒光探針(BCECF-AM)、DL-threo-二氫鞘氨醇(DL-threo-DHS)、NO特異清除劑(cPTIO)、動物一氧化氮合酶(NOS)抑制劑(L-NAME)、2-(N-嗎啡啉)乙烷磺酸(MES)、丁酸、二甲基亞砜(DMSO)，均購自Sigma-Aldrich (St Louis,MO)公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 植物材料處理

蠶豆(ViciafabaL.)種子購自漢中市種子公司。選取籽粒飽滿的蠶豆種子，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的HgCl2滅菌10 min，自來水沖洗干凈，于人工氣候箱中催芽，待胚根長至1 cm左右時(shí)，播種于盛有濕沙的瓷盤中，于人工氣候箱中培養(yǎng)。人工氣候箱中光源為白色冷熒光燈管(Philips,New York,USA)，培養(yǎng)條件為：相對濕度80%、光強(qiáng)300 μmol/(m2·s)、溫度(25±2) ℃、光/暗周期14 h/10 h。幼苗生長期間每天澆水1次，培養(yǎng)期間無任何水分脅迫。取生長3～4周蠶豆幼苗頂端完全展開的第1，2對葉片，撕取其下表皮，分割成約5 mm×5 mm的表皮條作為試驗(yàn)材料。

1.3 氣孔開度的測定

氣孔試驗(yàn)參照McAinsh等[24]的方法并稍作修改。

為研究DL-threo-DHS、DMS、cPTIO和L-NAME對暗誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的效應(yīng)，將新鮮撕取的蠶豆表皮條分別置于MES/KCl緩沖液(10 mmol/L MES/KOH，50 mmol/L KCl，100 μmol/L CaCl2，pH 6.15)中于光下(光強(qiáng)300 μmol/(m2·s)，光處理對照)和暗中處理(暗處理對照)3 h，同時(shí)在暗條件下將表皮條分別置于含有15 μmol/L DL-threo-DHS(暗+DL-threo-DHS)、5 μmol/L DMS(暗+DMS)、200 μmol/L cPTIO(暗+cPTIO)和25 μmol/L L-NAME(暗+L-NAME)的MES/KCl緩沖液中，處理3 h，溫度均為(25±2) ℃。

為研究外源Phyto-S1P對氣孔開度的影響，將新鮮撕取的蠶豆表皮條置于含有不同濃度(0，2，4，6和8 μmol/L)Phyto-S1P的MES/KCl緩沖液(組成同前)中于光下處理3 h(對照)；或?qū)hyto-S1P于光下處理3 h后，再置于不含任何處理試劑的MES/KCl緩沖液中繼續(xù)于光下處理3 h(洗脫試驗(yàn))，光強(qiáng)均為300 μmol/(m2·s)，溫度為(25±2) ℃。

為研究cPTIO和L-NAME對Phyto-S1P誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉的抑制效應(yīng)，將新鮮撕取的蠶豆表皮條置于MES/KCl緩沖液中(CK)，或置于含有6 μmol/L Phyto-S1P、200 μmol/L cPTIO、25 μmol/LL-NAME及6 μmol/L Phyto-S1P和200 μmol/L cPTIO共處理(P+T)、6 μmol/L Phyto-S1P和25 μmol/LL-NAME共處理(P+L)的MES/KCl緩沖液中，于光下(300 μmol/(m2·s))處理3 h，溫度為(25±2) ℃。

為研究丁酸對Phyto-S1P誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的效應(yīng)，將新鮮撕取的蠶豆表皮條置于MES/KCl緩沖液中，或置于含有6 μmol/L Phyto-S1P、不同濃度(0，0.5，1.0，1.5和 2.0 mmol/L)丁酸及6 μmol/L Phyto-S1P和不同濃度(0，0.5，1.0，1.5和2.0 mmol/L)丁酸共處理的MES/KCl緩沖液中，于光下(300 μmol/(m2·s))處理3 h，溫度為(25±2) ℃。

上述處理結(jié)束后，用經(jīng)臺式測微尺標(biāo)定的帶目鏡測微尺的光學(xué)顯微鏡分別測量氣孔開度。氣孔開度測量在每日的相同時(shí)間進(jìn)行，以避免可能存在的氣孔運(yùn)動節(jié)律對測量結(jié)果的影響。每處理至少重復(fù)3次，每次隨機(jī)測量30個(gè)氣孔。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以90個(gè)測量值的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

1.4 保衛(wèi)細(xì)胞NO和胞質(zhì)pH的檢測

以DAF-2 DA為探針測定保衛(wèi)細(xì)胞NO水平，參照Kojima等[25]的方法并稍加修改。以DMSO(體積分?jǐn)?shù)1%)為溶劑配制10 mmol/L的DAF-2 DA母液，4 ℃保存。以BCECF-AM為探針檢測保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)pH，參照Irving等[9]的方法并稍做修改，以DMSO(體積分?jǐn)?shù)1%)為溶劑配制1 mg/mL的BCECF-AM母液，-20 ℃保存。

為研究DL-threo-DHS、DMS、cPTIO和L-NAME對暗誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞NO生成的影響，以及cPTIO和L-NAME對Phyto-S1P處理引起的保衛(wèi)細(xì)胞NO水平變化的效應(yīng)，取新鮮撕取的蠶豆表皮條按照1.3節(jié)所述方法進(jìn)行處理；為研究丁酸對暗誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞NO生成的效應(yīng)，取新鮮撕取的蠶豆表皮條置于MES/KCl緩沖液中，于光下(光強(qiáng)300 μmol/(m2·s)，光處理對照)和暗中(暗處理對照)處理，同時(shí)將表皮條置于含有0.5 mmol/L丁酸的MES/KCl緩沖液中于暗中處理(暗+丁酸)，處理溫度均為(25±2) ℃，處理時(shí)間均為3 h；為研究丁酸對Phyto-S1P處理引起的保衛(wèi)細(xì)胞NO水平變化的效應(yīng)，取新鮮撕取的蠶豆表皮條置于MES/KCl緩沖液中(CK)，或置于含有0.5 mmol/L丁酸、6 μmol/L Phyto-S1P及6 μmol/L Phyto-S1P與0.5 mmol/L 丁酸共處理(P+B)的MES/KCl緩沖液中，于光下(300 μmol/(m2·s))處理3 h，溫度為(25±2) ℃；上述處理結(jié)束之后立即將表皮條放入含有10 μmol/L DAF-2 DA的Tris-KCl(10 mmol/L Tris、50 mmol/L KCl、pH 7.2)裝載緩沖液中，于(25±2) ℃下避光裝載1 h。

為研究DL-threo-DHS和DMS對暗誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)pH變化的效應(yīng)，將新鮮撕取的蠶豆表皮條分別置于MES/KCl緩沖液中，于光下(300 μmol/(m2·s))和暗中處理，同時(shí)將表皮條置于含有15 μmol/L DL-threo-DHS和5 μmol/L DMS的MES/KCl緩沖液中于暗中處理，處理溫度為(25±2) ℃，處理時(shí)間為3 h；為研究丁酸對Phyto-S1P處理引起的保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)pH變化的效應(yīng)，取新鮮撕取的蠶豆表皮條置于MES/KCl緩沖液中(CK)，或置于含有0.5 mmol/L 丁酸、6 μmol/L Phyto-S1P及6 μmol/L Phyto-S1P和0.5 mmol/L 丁酸共處理(P+B)的MES/KCl緩沖液中于光下處理3 h，溫度為(25±2) ℃；上述處理結(jié)束之后立即將表皮條放入含有20 μmol/L BCECF-AM的Tris-KCl裝載緩沖液中，于(25±2) ℃避光裝載10 min。為利于BCECF-AM的裝載，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05% Pluronic F-127于Tris-KCl 裝載緩沖液中。裝載完成后，用Tris-KCl裝載緩沖液于暗中沖洗掉表皮條表面的多余探針，立即以TCS SP5型激光掃描共聚焦顯微鏡(Leica Lasertechnik Gmbh,Heidelberg)進(jìn)行檢測。共聚焦顯微鏡的檢測參數(shù)設(shè)置為：激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長505～530 nm，常規(guī)掃描速度。所得圖像用Leica Image Software和Photoshop 7.0進(jìn)行分析。

為了檢測Phyto-S1P導(dǎo)致的保衛(wèi)細(xì)胞NO水平和胞質(zhì)pH變化的時(shí)間進(jìn)程，將新鮮撕取的蠶豆表皮條置于MES/KCl緩沖液中，于光下(光強(qiáng)300 μmol/(m2·s))處理3 h以使氣孔開放，然后立即將表皮條放入含有10 μmol/L DAF-2 DA的Tris-KCl裝載緩沖液中，避光裝載1 h，同時(shí)將表皮條放入含有20 μmol/L BCECF-AM和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05% Pluronic F-127的Tris-KCl裝載緩沖液中，避光裝載10 min，裝載溫度為(25±2) ℃；以Tris-KCl裝載緩沖液沖洗掉表皮條表面的多余探針后，用Tris-KCl裝載緩沖液孵育表皮條并將 Phyto-S1P(終濃度6 μmol/L)直接加入該緩沖液中，然后用共聚焦顯微鏡(參數(shù)同上)檢測30 min內(nèi)保衛(wèi)細(xì)胞DAF-2 DA和BCECF-AM熒光的變化。

所有樣品的共聚焦圖像均在同一條件(手動設(shè)置)下采集。每次處理檢測3個(gè)表皮條，每處理至少重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)用One-way ANOVA進(jìn)行差異顯著性分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較，以P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Phyto-S1P誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞NO產(chǎn)生與其介導(dǎo)暗誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的關(guān)系

She等[22]的研究顯示，保衛(wèi)細(xì)胞NO水平升高為暗誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的必需條件。為探明Phyto-S1P是否介導(dǎo)暗誘導(dǎo)蠶豆氣孔關(guān)閉，以及暗誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉期間Phyto-S1P與NO產(chǎn)生是否有關(guān)，本研究檢測了DL-threo-DHS和DMS(哺乳動物中LCBK的2種抑制劑)對暗誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉和保衛(wèi)細(xì)胞NO水平升高的效應(yīng)。圖1結(jié)果顯示，在暗培養(yǎng)條件下，與光處理相比，15 μmol/L DL-threo-DHS和5 μmol/L DMS顯著抑制暗誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉(P<0.05)，且與cPTIO、L-NAME的效應(yīng)相似。與光處理(圖2-A，G)相比，暗處理誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞產(chǎn)生了強(qiáng)烈的DAF-2 DA熒光(圖2-B，G)；而4種試劑均對暗處理DAF-2 DA熒光的產(chǎn)生有一定抑制作用(圖2-C，D，E，F(xiàn)，G)。由DL-threo-DHS和DMS抑制暗誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉和NO產(chǎn)生的結(jié)果可以得出，Phyto-S1P可能通過誘導(dǎo)NO產(chǎn)生介導(dǎo)暗誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉。

為進(jìn)一步證明Phyto-S1P通過誘導(dǎo)NO產(chǎn)生介導(dǎo)暗誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉，本研究檢測了外源Phyto-S1P對氣孔開度和NO產(chǎn)生的效應(yīng)。結(jié)果顯示，≥4 μmol/L的Phyto-S1P可顯著誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉(P<0.05)，6 μmol/L為最適濃度；洗脫試驗(yàn)結(jié)果顯示，Phyto-S1P對氣孔開度的效應(yīng)可以逆轉(zhuǎn)，而不是由不可逆的細(xì)胞毒性引起的(圖3-A)。Phyto-S1P誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉和NO產(chǎn)生可被cPTIO和L-NAME顯著阻止(P<0.05)(圖3-B，C)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，Phyto-S1P通過誘導(dǎo)NO產(chǎn)生介導(dǎo)暗誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉。

圖1 DL-threo-DHS、DMS、cPTIO和L-NAME對暗誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的影響

圖2 DL-threo-DHS、DMS、cPTIO和L-NAME對保衛(wèi)細(xì)胞NO產(chǎn)生的影響

2.2 Phyto-S1P提高保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)pH與其參與暗誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的關(guān)系

要確定Phyto-S1P在暗誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉中的作用，需研究暗誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉期間Phyto-S1P與胞質(zhì)pH變化的關(guān)系，本研究首先分析了DL-threo-DHS和DMS對暗誘導(dǎo)胞質(zhì)pH變化的效應(yīng)。結(jié)果顯示，與光處理(圖4-A，E)相比，暗處理可以顯著提高保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)pH水平(P<0.05)(圖4-B，E)；而暗誘導(dǎo)的保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)pH升高可被15 μmol/L DL-threo-DHS和5 μmol/L DMS顯著抑制(P<0.05)(圖4-C，D，E)。由此可以得出，Phyto-S1P可能通過提高保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)pH水平參與暗誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉。

為進(jìn)一步證實(shí)暗誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉中Phyto-S1P的作用及其與保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)pH升高(胞質(zhì)堿化)的相關(guān)關(guān)系，本研究檢測了丁酸(常用以調(diào)節(jié)保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)pH[14])對外源Phyto-S1P誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉和保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)pH變化的效應(yīng)。結(jié)果顯示，外源Phyto-S1P顯著誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉(P<0.05)，而≥0.5 mmol/L 丁酸處理對Phyto-S1P誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉有顯著抑制效應(yīng)(P<0.05)(圖4-F)。與對照(CK)相比，Phyto-S1P可顯著誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)堿化 (P<0.05)，而0.5 mmol/L丁酸可顯著抑制Phyto-S1P誘導(dǎo)的胞質(zhì)pH升高(P<0.05)，且丁酸單獨(dú)處理對保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)pH無明顯抑制效應(yīng)(P>0.05)(圖4-G)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，Phyto-S1P通過誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)堿化參與暗誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉。

圖3 cPTIO和L-NAME對外源Phyto-S1P誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉和保衛(wèi)細(xì)胞NO產(chǎn)生的影響

圖4 Phyto-S1P參與暗誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉過程中pH的變化

2.3 暗誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉期間Phyto-S1P誘導(dǎo)的保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)堿化與NO產(chǎn)生的關(guān)系

在證實(shí)Phyto-S1P通過誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞NO產(chǎn)生和提高胞質(zhì)pH介導(dǎo)暗誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的基礎(chǔ)上，需進(jìn)一步探明Phyto-S1P誘導(dǎo)的胞質(zhì)pH升高與NO產(chǎn)生的關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果顯示，與光處理相比，暗處理可以顯著誘導(dǎo)NO產(chǎn)生(P<0.05)，而暗誘導(dǎo)NO產(chǎn)生的效應(yīng)可被丁酸顯著抑制(P<0.05)(圖5-A)。結(jié)合前文得到的Phyto-S1P誘導(dǎo)的胞質(zhì)pH升高和NO產(chǎn)生均參與暗誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的結(jié)果(圖1,2，3和 4)，可以推斷，暗誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉期間Phyto-S1P引起的胞質(zhì)堿化是NO產(chǎn)生的先決條件。

圖5 Phyto-S1P誘導(dǎo)的保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)堿化與NO產(chǎn)生的關(guān)系

試驗(yàn)結(jié)果(圖5-B，C)還顯示，對照保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)pH和NO水平在30 min內(nèi)未見明顯變化；外源Phyto-S1P處理6 min時(shí)保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)pH顯著升高(P<0.05)，處理18 min時(shí)達(dá)到最大值(圖5-B)；而Phyto-S1P處理8 min時(shí)NO水平才開始顯著升高(P<0.05)，于處理24 min時(shí)達(dá)到峰值(圖5-C)。同時(shí)，丁酸顯著抑制外源Phyto-S1P誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生(P<0.05)(圖5-D)。這些結(jié)果進(jìn)一步證明了暗誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉中Phyto-S1P誘導(dǎo)的胞質(zhì)堿化是NO產(chǎn)生的先決條件的推斷。

3 討 論

鞘脂是膜脂的主要成分，鞘脂代謝物S1P和Phyto-S1P是保衛(wèi)細(xì)胞ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要信號分子[3-8]。目前，Phyto-S1P和SPHK已被證明參與ABA調(diào)控的擬南芥氣孔運(yùn)動[5-7]。本研究結(jié)果顯示，暗處理可以誘導(dǎo)蠶豆氣孔關(guān)閉，外源Phyto-S1P可以模擬暗處理對氣孔開度的影響效應(yīng)，暗誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉可被LCBK抑制劑DL-threo-DHS和DMS顯著抑制。由于LCBK也可以磷酸化鞘氨醇，且S1P也能促進(jìn)蠶豆和擬南芥氣孔關(guān)閉[3-4,8]，故本試驗(yàn)結(jié)果不排除S1P參與暗誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的可能性[8]。

已有的研究結(jié)果顯示，Phyto-S1P和NO均參與ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉[5,7,20,26]。本研究結(jié)果顯示，外源Phyto-S1P可以模擬暗效應(yīng)誘導(dǎo)NO產(chǎn)生。DL-threo-DHS和DMS對暗誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生有顯著的抑制效應(yīng)。這些結(jié)果表明，Phyto-S1P通過誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞NO產(chǎn)生介導(dǎo)暗誘導(dǎo)蠶豆氣孔關(guān)閉。另外，Phyto-S1P誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生可被L-NAME顯著抑制，暗示其類似NOS負(fù)責(zé)催化Phyto-S1P誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉過程中的NO產(chǎn)生。

pH在植物很多生理反應(yīng)包括氣孔運(yùn)動中具有重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[8,10-11,14]。降低保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)pH的效應(yīng)劑(如IAA和FC)可促使氣孔開放[9]，而提高保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)pH的效應(yīng)劑(如ABA和MJ)則促進(jìn)氣孔關(guān)閉[12,16]。前人的研究結(jié)果顯示，ABA和MJ誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉中，保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)堿化發(fā)生于NO產(chǎn)生之前[14,27]。然而，尚不清楚Phyto-S1P是否通過影響胞質(zhì)pH進(jìn)而調(diào)控氣孔運(yùn)動。本研究結(jié)果顯示，DL-threo-DHS和DMS可顯著抑制暗誘導(dǎo)的保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)pH升高和氣孔關(guān)閉，而外源Phyto-S1P可模擬暗處理顯著誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)pH升高和氣孔關(guān)閉。此外，Phyto-S1P對胞質(zhì)pH和氣孔開度的效應(yīng)可被丁酸顯著抑制。以上結(jié)果表明，Phyto-S1P通過引起保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)pH升高(胞質(zhì)堿化)參與暗誘導(dǎo)蠶豆氣孔關(guān)閉。

雖然已經(jīng)清楚保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)堿化是ABA和MJ誘導(dǎo)NO產(chǎn)生和氣孔關(guān)閉中的一個(gè)早期事件[14,27]，但尚不清楚暗誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉中胞質(zhì)堿化是否為NO產(chǎn)生的誘因。本研究顯示，暗誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞NO產(chǎn)生可被丁酸顯著抑制，結(jié)合本研究得到的暗處理顯著誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)堿化、NO產(chǎn)生和氣孔關(guān)閉的結(jié)果，由此可以推斷，暗誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉期間保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)堿化是NO產(chǎn)生的誘導(dǎo)因素；而外源Phyto-S1P處理后，胞質(zhì)pH升高較NO水平增加的滯后期更短且達(dá)到峰值更早，且外源Phyto-S1P誘導(dǎo)的保衛(wèi)細(xì)胞NO產(chǎn)生可被丁酸顯著抑制，這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)論。

4 結(jié) 論

Phyto-S1P參與了暗誘導(dǎo)蠶豆葉片氣孔關(guān)閉的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，且其是通過提高保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)pH和NO水平介導(dǎo)暗誘導(dǎo)的蠶豆氣孔關(guān)閉過程，保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)pH升高是NO產(chǎn)生的誘導(dǎo)因素。

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