雞恒定鏈功能片段跨物種增強(qiáng)小鼠對(duì)新城疫F2抗原免疫作用的研究

王 琛，劉雪蘭，陳芳芳，余為一

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 安徽省人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230036)

肽疫苗具有特異性強(qiáng)、安全、有效等特點(diǎn)，目前已經(jīng)應(yīng)用于癌癥、糖尿病等疾病的治療[1-2]，構(gòu)建具有增強(qiáng)抗原遞呈免疫載體的嵌合體肽疫苗無疑是一種提高治療效果的有效方法。恒定鏈(Invariant chain，Ii)是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，呈非多態(tài)性[3-4]，作為MHCⅡ類分子伴侶蛋白，在遞呈外源性抗原的過程中發(fā)揮著重要作用。Ii的CLIP片段占據(jù)MHCⅡ類分子內(nèi)的肽結(jié)合區(qū)凹槽，阻止內(nèi)源性多肽的結(jié)合[5-6]；當(dāng)外源性抗原肽進(jìn)入時(shí)，凹槽中的CLIP片段被酶解，抗原肽進(jìn)入凹槽并被遞呈到細(xì)胞表面，以便被CD4+Th細(xì)胞識(shí)別，從而激活免疫應(yīng)答[7]。

用抗原肽取代Ii的CLIP片段的嵌合體，其抗原肽占據(jù)MHCⅡ類分子“凹槽”，優(yōu)先進(jìn)入MHCⅡ類分子輸運(yùn)呈遞途徑，不僅可增強(qiáng)抗感染免疫，還可以改變異常免疫應(yīng)答的性質(zhì)[8]。Adams等[9]報(bào)道，用Ii關(guān)鍵基團(tuán)Ii-key結(jié)構(gòu)(即四肽LRMK，與CLIP區(qū)N端相連)與抗原肽連接構(gòu)建的嵌合體具有免疫增強(qiáng)作用。目前，Ii-key結(jié)構(gòu)成為重要的免疫載體，并在多肽疫苗中得到了應(yīng)用[10-13]。此外，用小鼠Ii跨膜區(qū)(Cyt)、胞漿區(qū)(Tm)的功能片段連接抗原肽免疫小鼠，能夠增強(qiáng)免疫效應(yīng)[14]。但是尚不清楚Ii這些功能片段的作用是否具有跨物種的限制。為此，本研究構(gòu)建了基于雞Ii功能片段和新城疫病毒(NDV)的F306肽段中第二個(gè)抗原表位(即F2片段[15])的多個(gè)嵌合體，用其免疫小鼠，通過細(xì)胞共定位和抗體水平研究雞Ii活性片段在小鼠體內(nèi)的免疫效果，以期為構(gòu)建跨物種免疫載體奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

COS-7細(xì)胞、Rosetta(DE3)以及DH5α均由安徽省人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；限制性內(nèi)切酶、DL 2000 Marker、T4 DNA連接酶以及Premix ExTaq購自寶生物工程有限公司；小量質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒等均購自O(shè)MEGA生物工程公司。用激光共聚焦顯微鏡(FV1000)的60×油鏡分別觀察紅色熒光(488 nm)和綠色熒光(515 nm)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

8周齡昆明系雌性小白鼠，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 嵌合體的構(gòu)建

根據(jù)雞Ii鏈以及新城疫病毒F蛋白結(jié)構(gòu)，以安徽省人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-F306、pEGFP-C1-Ii為模板，根據(jù)質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)和目的基因片段序列，自行設(shè)計(jì)7對(duì)引物(表1)，由寶生物工程有限公司合成。采用PCR法構(gòu)建嵌合體Ii-F2、Cyt/Tm/Ii-key/F2/Ap、Tm/Ii-key/F2/Ap、Ii-key/F2/Ap和Ii-key/F2，其結(jié)構(gòu)見圖1。PCR反應(yīng)體系為TaqBuffer(Mg+Plus) 5.0 μL、dNTP Mixture 4.0 μL、引物F 1.0 μL、引物R 1.0 μL、pEGFP-C1-Ii 0.5 μL和RTaq0.5 μL，加ddH2O至終容積150.0 μL；反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃熱變性40 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min， 4 ℃終止反應(yīng)。

表1 基因片段與嵌合體引物序列

圖1 嵌合體結(jié)構(gòu)示意圖

將各嵌合體片段分別插入pET-32a、pGEX-4T-1載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-Ii、pET-32a-Ii-F2、pET-32a-Cyt/Tm/Ii-key/F2/AP、pET-32a-Tm/Ii-key/F2/AP、pET-32a-Ii-key/F2/AP、pET-32a-Ii-key/F2、pET-32a-F2和pGEX-4T-1-F2，將其轉(zhuǎn)化至E.coliRosetta(DE3)工程菌中，然后將轉(zhuǎn)化后的菌株送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序鑒定；同時(shí)，提取重組質(zhì)粒用BamHⅠ/SalⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和雙酶切產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.4 嵌合體抗原的制備與小鼠免疫

將上述1.2節(jié)中獲得的重組菌加入適量的IPTG(終濃度為1.0 mmol/L)，振蕩培養(yǎng)5 h。用超聲波破碎菌體(180 W超聲5 s，間隔10 s，36個(gè)循環(huán))，經(jīng)Native-PAGE電泳后，按于在江等[16]的方法用0.25 mol/L KCl切膠法純化融合蛋白，對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。

將試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為6個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組3只，6個(gè)試驗(yàn)組小鼠分別用純化的His-Ii-F2、His-Cyt/Tm/Ii-key/F2/AP、His-Tm/Ii-key/F2/AP、His-Ii-key/F2/AP、His-Ii-key/F2和His-F2融合蛋白腹腔注射免疫約100 μL/只，免疫劑量為50 μg/只。對(duì)照組小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水。常規(guī)免疫5周后眼球采血，收集血清，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 抗體檢測

采用間接ELISA法檢測嵌合體抗體效價(jià)，以重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-F2表達(dá)的GST-F2融合蛋白作為抗原包被酶標(biāo)板。以辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗，最后以鄰苯二胺(OPD) 進(jìn)行顯色反應(yīng)，室溫放置10～15 min后終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測492 nm 波段的吸光值，并對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。每個(gè)樣品重復(fù)3孔。

1.6 真核載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及共定位觀察

為探究雞Ii是否能與小鼠MHCⅡ類分子結(jié)合，本試驗(yàn)還用含雞Ii基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pmCherry-C1-Ii，以及含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(GFP)和小鼠MHCⅡα鏈、β鏈的pEGFP-MHCⅡα和pEGFP-MHCⅡβ的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)LipofectamineTM2000共轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞[14]，轉(zhuǎn)染48 h后置于激光共聚焦顯微鏡(Zeiss)下，觀察雞Ii與小鼠MHCⅡα、β鏈的共定位情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ii功能片段-抗原肽嵌合體的鑒定

圖2顯示，嵌合體的PCR擴(kuò)增獲得了710 bp的Ii、692 bp的Ii-F2、374 bp的Cyt/Tm/Ii-key/F2/AP、300 bp的Tm/Ii-key/F2/AP、152 bp的Ii-key/F2/AP、146 bp的Ii-key/F2、128 bp的F2，重組質(zhì)粒pET-32a-Ii、pET-32a-Ii-F2、 pET-32a-Cyt/Tm/Ii-key/F2/AP、pET-32a-Tm/Ii-key/F2/AP、pET-32a-Ii-key/F2/AP、pET-32a-Ii-key/F2和pET-32a-F2經(jīng)BamHⅠ/SalⅠ雙酶切，均獲得了預(yù)期長度的目的片段。測序結(jié)果顯示，所有克隆的DNA序列與模板序列一致。該結(jié)果表明，本試驗(yàn)成功地構(gòu)建了Ii功能片段的嵌合體。

2.2 嵌合體融合蛋白的純化

對(duì)純化的嵌合體融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。圖3結(jié)果顯示，在44.7(His-Ii-F2)，33.2(His-Cyt/Tm/Ii-key/F2/AP)，29.2(His-Tm/Ii-key/F2/AP)，24.4(His-Ii-key/F2/AP)，24.0(His-Ii-key/F2)和23.8(His-F2)ku處有相應(yīng)的目的條帶，大小與預(yù)期結(jié)果相符。

2.3 Ii功能片段誘導(dǎo)的抗體水平

用pGEX-4T-1-F2重組質(zhì)粒表達(dá)的帶GST標(biāo)簽的GST-F2融合蛋白作為包被抗原，經(jīng)間接ELISA檢測，結(jié)果(圖4)顯示，對(duì)照組小鼠抗F2抗體效價(jià)約為(0.7±0.06)×104，而Ii-key/F2、Ii-key/F2/AP、Cyt/Tm/Ii-key/F2/AP、Tm/Ii-key/F2/AP和Ii-F2融合蛋白免疫組抗F2的抗體水平為1.2×104～2.2×104，分別為對(duì)照組的1.5，2.5，3，3和3倍。這表明以雞Ii功能片段為載體構(gòu)建的嵌合體在小鼠體內(nèi)均具有不同程度的免疫增強(qiáng)作用。

圖2 嵌合體的PCR擴(kuò)增及其重組質(zhì)粒的BamHⅠ/SalⅠ雙酶切鑒定

圖3 純化后嵌合體融合蛋白的SDS-PAGE電泳檢測

2.4 雞Ii與小鼠MHCⅡ類分子的共定位

激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果(圖5)表明，在細(xì)胞相同位置共定位的蛋白分子會(huì)形成橙色熒光。該結(jié)果說明，雞Ii與鼠MHCⅡ類分子能在細(xì)胞膜上共定位，表示兩者具有相互作用。

3 討 論

MHCⅡ類分子的多態(tài)性是動(dòng)物與病原長期選擇的結(jié)果，MHCⅡ分子與抗原肽之間的親和力大小與抗原遞呈效應(yīng)密切相關(guān)[17]。Ii作為MHCⅡ分子的重要伴侶，在其遞呈抗原過程中起重要的輔助作用。Kim等[18]用人乳突淋瘤病毒(Human papilloma virus，HPV-16)抗原肽E6、E7連接Ii共免疫小鼠，增強(qiáng)了特異性CD8+T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答，提高了小鼠存活期。Zinckgraf等[19]用禽流感病毒H5N1的HA抗原表位與人Ii-key連接后對(duì)志愿者免疫，發(fā)現(xiàn)其免疫效果較單一抗原免疫增強(qiáng)了3～10倍。Voutsas等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Ii-Key/HER-2/neu 776-790aa嵌合體多肽能夠誘導(dǎo)促進(jìn)細(xì)胞增殖并增強(qiáng)CD4+T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答，還能明顯增強(qiáng)特異性CD8+T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[21]，而且特異性抗體水平也有明顯提高[22]。

圖5 雞Ii與小鼠MHCⅡ類分子在COS7細(xì)胞中的共定位

雞恒定鏈與人和小鼠等哺乳動(dòng)物Ii存在約60%的同源性，主要的功能區(qū)序列保守。本研究通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，雞的Ii能夠與小鼠MHCⅡα或β鏈在COS7細(xì)胞內(nèi)共定位，并且經(jīng)過體內(nèi)試驗(yàn)證明，用雞Ii-key及其活性片段攜帶抗原肽免疫小鼠能夠增強(qiáng)特異性體液免疫應(yīng)答水平。對(duì)于免疫增強(qiáng)的效果，各個(gè)功能片段所起的作用并不相同：雞恒定鏈CLIP區(qū)N端的Ii-key結(jié)構(gòu)能夠促進(jìn)抗原肽與MHCⅡ分子的結(jié)合，而N端的胞漿區(qū)、跨膜區(qū)和C端的AP結(jié)構(gòu)均能起到輔助作用，可進(jìn)一步增強(qiáng)免疫效果。此外，有研究還表明，鵪鶉Ii與雞和小鼠的MHCⅡα或β鏈也存在跨越種間的相互作用[23]。上述結(jié)果表明，盡管禽類與哺乳動(dòng)物Ii之間存在序列上的差異，但是作為MHCⅡ分子伴侶的Ii，在禽類與哺乳動(dòng)物中均維持相似的功能特性，而且異種Ii可以跨越物種限制。此外，Ii具有可連接多種抗原肽的潛力，并且可以不使用免疫佐劑[2]，這為Ii成為跨物種抗原肽載體的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)提供了依據(jù)。但是不同物種，如哺乳動(dòng)物與禽類的Ii，尤其是Ii-key氨基酸序列存在明顯不同，選擇何種Ii功能片段作為免疫載體最為有效，還有待于進(jìn)一步研究。

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