6種黃酮類化合物清除超氧陰離子自由基能力及其構(gòu)效關(guān)系

趙靜 李玉琴 王芳喬 賈寶秀 劉彩紅 王仁亮

1.山東省泰山療養(yǎng)院，山東泰安271000；2.泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東泰安271016；3.泰山醫(yī)學(xué)院化工學(xué)院，山東泰安271016

6種黃酮類化合物清除超氧陰離子自由基能力及其構(gòu)效關(guān)系

趙靜1李玉琴2▲王芳喬2賈寶秀2劉彩紅2王仁亮3

1.山東省泰山療養(yǎng)院，山東泰安271000；2.泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東泰安271016；3.泰山醫(yī)學(xué)院化工學(xué)院，山東泰安271016

目的測(cè)定槲皮素、根皮苷、楊梅素、原花青素、葛根素和柚皮苷對(duì)超氧陰離子自由基（O-2·）的清除能力，探討6種化合物清除O-2·的構(gòu)效關(guān)系。方法采用流動(dòng)注射鄰苯三酚-魯米諾化學(xué)發(fā)光法測(cè)定6種化合物對(duì)O-2·的清除率，采用IC50來(lái)衡量樣品對(duì)自由基的清除能力。以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果槲皮素、根皮苷、楊梅素、柚皮苷、葛根素、原花青素對(duì)O-2·的抑制率分別為0.1547、0.2048、0.4623、0.6157、1.8098、2.9798 μmol/L。6種化合物清除O-2·能力從大到小依次為槲皮素、根皮苷、楊梅素、柚皮苷、葛根素、原花青素，均高于維生素C（4.9586 μmol/L）。結(jié)論6種黃酮類化合物結(jié)構(gòu)與清除O-2·能力密切相關(guān)：酚羥基是其清除O-2·的必要基團(tuán)，B環(huán)的羥基化程度、羥基的數(shù)目和位置，C環(huán)開(kāi)環(huán)后形成的羥基和雙鍵，A環(huán)取代基的位置、數(shù)目以及化合物的空間結(jié)構(gòu)，均是影響抗氧化活性的重要因素。

6種黃酮類化合物；超氧陰離子自由基；清除率；構(gòu)效關(guān)系

生物體在自身的新陳代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，超氧陰離子自由基（O-2·）是具有代表性的活性氧自由基之一。研究表明，許多疾病，如癌癥、循環(huán)系統(tǒng)疾病、代謝失調(diào)、光損傷、毒物侵害等都與人體內(nèi)的自由基有關(guān)。O-2·的破壞作用是通過(guò)一系列鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)現(xiàn)的，可引發(fā)組織的不斷氧化消耗，其結(jié)果是破壞性和不可逆轉(zhuǎn)的，只能通過(guò)加入抗氧化劑終止鏈反應(yīng)。因此，尋找能夠清除活性氧自由基的抗氧化劑具有十分重要的意義。

眾多研究表明，天然黃酮類化合物有抗突變、抗腫瘤、抗炎、治療心血管疾病等廣泛生物學(xué)活性，其中最為重要的是它能減少自由基的形成和清除自由基[1-5]。然而黃酮類化合物種類繁多，其清除自由基的功效與每種化合物的具體結(jié)構(gòu)有關(guān)，因而不同的物質(zhì)可能對(duì)不同體系的抗氧化作用不同，對(duì)不同類型的自由基和組織也存在選擇性作用[6-10]。了解黃酮類化合物抗氧化、清除自由基的構(gòu)效關(guān)系，對(duì)于通過(guò)化學(xué)修飾的方法有效改變黃酮類化合物現(xiàn)有結(jié)構(gòu)弱點(diǎn)，增強(qiáng)其生物學(xué)活性，增大其實(shí)用價(jià)值有重要意義。

筆者通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究槲皮素、根皮苷、楊梅素、原花青素、葛根素和柚皮苷6種黃酮化合物對(duì)O-2·的清除能力，探討6種化合物抗氧化作用的構(gòu)效關(guān)系。

1 儀器與試藥

MPI-B型多功能化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器（西安瑞邁分析儀器有限公司），自動(dòng)電位滴定儀ZD-2型。槲皮素、根皮苷、楊梅素、原花青素、葛根素、柚皮苷和維生素C對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；鄰苯三酚、無(wú)水碳酸鈉、碳酸氫鈉（天津市博迪化工有限公司）；魯米諾（上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

魯米諾儲(chǔ)備液（1.0×10-2mol/L）：稱取適量魯米諾，用0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，并定容至50 mL棕色容量瓶，冰箱中儲(chǔ)存。

維生素C溶液（1.0×10-2mol/L）：稱取適量維生素C用水溶解，并定容至100 mL容量瓶中。

槲皮素、根皮苷、楊梅素、原花青素、葛根素、柚皮苷儲(chǔ)備液（1.0×10-2μg/mL）：用50%乙醇配制。

鄰苯三酚（0.01 mol/L）：用0.01 mol/L HCl配成儲(chǔ)備液，使用前用水稀釋。

Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液（0.01 mol/L）：臨用前新鮮配制。

2.2 流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法

實(shí)驗(yàn)管路見(jiàn)圖1。蠕動(dòng)泵分別泵入鄰苯三酚溶液S、魯米諾-碳酸鹽緩沖液C和空白或被測(cè)物R，在反應(yīng)器中混合并反應(yīng)，產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)。

圖1 流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光儀示意圖

2.3 流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法實(shí)驗(yàn)程序編寫(xiě)

為了使體系發(fā)光穩(wěn)定且發(fā)光較強(qiáng)，將增益設(shè)為3，高壓為600 V。為了減少泵管的損耗，將主泵速度設(shè)為30 r/min，副泵速度設(shè)為30 r/min。試驗(yàn)程序見(jiàn)表1。

表1 超氧陰離子自由基試驗(yàn)程序

2.4 O-2·檢測(cè)體系的優(yōu)化

鄰苯三酚在堿性條件下自氧化產(chǎn)生O-2·，O-2·與魯米諾發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生一個(gè)電子激發(fā)態(tài)的中間物，當(dāng)其返回基態(tài)時(shí)，可產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，反應(yīng)體系中O-2·的量可以間接地用化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度I來(lái)表示[11]。以發(fā)光的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性以及強(qiáng)度為依據(jù)分別考察緩沖液pH、鄰苯三酚和魯米諾濃度對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響。當(dāng)緩沖液pH=10，鄰苯三酚和魯米諾濃度分別為0.005、0.06 mmol/L時(shí)，體系的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性以及發(fā)光強(qiáng)度最佳。見(jiàn)圖2。

圖2 化學(xué)發(fā)光體系的優(yōu)化

2.5 抗氧化測(cè)定及抑制率計(jì)算

在最佳條件下，分別測(cè)定空白溶液的發(fā)光強(qiáng)度（I0）和一系列加入樣品溶液后體系的發(fā)光強(qiáng)度（IT）。根據(jù)發(fā)光信號(hào)的降低值（I0-IT），可定量分析6種化合物與維生素C清除O-2·的能力，可計(jì)算出加入不同濃度溶液后抑制發(fā)光的程度，即對(duì)自由基的抑制率：

抑制率=（I0－IT）/I0×100%

以發(fā)光抑制率為縱坐標(biāo)，樣品液濃度為橫坐標(biāo)，繪出發(fā)光抑制率曲線，并計(jì)算出發(fā)光抑制率為50%時(shí)的濃度IC50，用來(lái)衡量樣品對(duì)自由基的清除能力。IC50值越小，表明樣品清除自由基能力越強(qiáng)。每個(gè)樣品平行測(cè)定6次。

2.6 6種化合物對(duì)O-2·的清除能力

測(cè)定不同濃度槲皮素、根皮苷、楊梅素、原花青素、葛根素、柚皮苷和維生素C溶液對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響，O-2·的清除率，計(jì)算發(fā)光抑制率，并繪制發(fā)光抑制率曲線。見(jiàn)圖3。

圖36 種化合物和維生素C對(duì)O-2·的清除作用

由圖3可知，6種黃酮類化合物和維生素C溶液對(duì)O-2·的清除效果均呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系，即隨著溶液濃度的增大，其對(duì)O-2·的清除效果也增強(qiáng)。槲皮素、根皮苷、楊梅素、柚皮苷、葛根素、原花青素6種化合物和維生素C溶液對(duì)O-2·的清除率IC50值分別為0.1547、0.2048、0.4623、0.6157、1.8098、2.9798、4.9586 μmol/L。提示對(duì)O-2·的清除能力大小依次為槲皮素、根皮苷、楊梅素、柚皮苷、葛根素、原花青素、維生素C。

3 討論

3.1 黃酮類化合物結(jié)構(gòu)

黃酮類化合物是以2-苯基色原酮為母核的一類物質(zhì)，兩個(gè)芳環(huán)（A、B環(huán)）之間以一個(gè)三碳鏈相連，具有C6-C3-C6基本構(gòu)型，將三個(gè)環(huán)分別標(biāo)為A、B、C（圖4）。其母核上帶有羥基、甲氧基、羥氧基等取代基分別形成各種黃酮類化合物，以游離苷原或以與糖結(jié)合的苷類等形式存在于許多植物中。黃酮類各環(huán)上的羥基活性相差較大：B環(huán)的酚羥基活性最高；當(dāng)C環(huán)上羥基和不飽和雙鍵相連時(shí)，C環(huán)也具有較強(qiáng)的抗氧化活性，A環(huán)的酚羥基活性最弱。

3.2 B環(huán)與抗氧化性

B環(huán)上的羥基化程度是抗氧化活性的一個(gè)主要因素，含鄰位酚羥基黃酮類化合物與自由基反應(yīng)形成了較為穩(wěn)定的共軛半醌式自由基，從而中斷游離自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，所以具有較強(qiáng)的抗氧化性。B環(huán)中的鄰二酚羥基對(duì)黃酮類化合物的抗氧化活性起主要作用，具有強(qiáng)抗氧化活性的這類物質(zhì)一般都有3′，4′-鄰苯二酚結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)中，槲皮素和楊梅素具有3′，4′-鄰苯二酚結(jié)構(gòu)，它們?cè)?種化合物中抗氧化活性較強(qiáng)。羥基的位置和數(shù)目與抗氧化活也有密切的關(guān)系，羥基數(shù)目和位置的差異，使化合物表現(xiàn)出不同程度的抗氧化活性。本實(shí)驗(yàn)IC50值表明，槲皮素抗氧化活性遠(yuǎn)大于楊梅素，故可推測(cè)楊梅素B環(huán)5′位羥基抑制其抗氧化活性。

3.3 C環(huán)與抗氧化性

黃酮化合物C環(huán)的3位羥基是很重要的結(jié)構(gòu)，3位上的羥基與2，3位間的雙鍵可以發(fā)生異構(gòu)化，變成二酮式，此結(jié)構(gòu)在二位上產(chǎn)生具有較高活性的-CH-基團(tuán)，不飽和C環(huán)延長(zhǎng)了A、B環(huán)的共軛體系，使苯氧自由基更加穩(wěn)定，增強(qiáng)了抗氧化活性。本實(shí)驗(yàn)中，槲皮素、楊梅素具有此結(jié)構(gòu)，因此兩者具有很強(qiáng)的抗氧化活性。通過(guò)比較根皮苷和柚皮苷的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，根皮苷C環(huán)開(kāi)環(huán)且兩種化合物氧糖苷的位置不同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，根皮苷的抗氧化活性遠(yuǎn)大于柚皮苷，因此推測(cè)C環(huán)的開(kāi)環(huán)結(jié)構(gòu)和糖苷鍵的位置能夠影響黃酮類化合物的抗氧化活性。一般認(rèn)為，7位氧糖苷對(duì)活性不利，C環(huán)開(kāi)環(huán)結(jié)構(gòu)有助于增強(qiáng)化合物的抗氧化活性[12]。3.4 A環(huán)與抗氧化性

圖46 種黃酮類化合物結(jié)構(gòu)

天然黃酮類化合物A環(huán)的羥基大多處在C5和C7，不像B環(huán)那樣，一般均具有鄰二酚羥基。過(guò)去認(rèn)為，A環(huán)不易被氧化，因而不直接參與抗氧化反應(yīng)，但近來(lái)研究表明，A環(huán)也可發(fā)揮抗氧化作用[13]。同時(shí)，A環(huán)上的5，7位羥基有利于抗氧化活性，本實(shí)驗(yàn)中葛根素只有7位羥基，沒(méi)有5位羥基，其抗氧化活性較弱。有實(shí)驗(yàn)表明，7位羥基在4′羥基存在時(shí)可以提高抗氧化活性[14]，本實(shí)驗(yàn)所研究的化合物均具有這種結(jié)構(gòu)，IC50值表明它們的抗氧化活性均強(qiáng)于維生素C，故均具有很強(qiáng)的抗氧化活性。本實(shí)驗(yàn)表明，柚皮苷的抗氧化活性大于葛根素，因其A環(huán)上2′位多了一個(gè)多羥基環(huán)氧化物，故可推測(cè)A環(huán)上的取代基會(huì)影響黃酮類化合物的抗氧化活性[15-17]。

3.5 空間結(jié)構(gòu)與抗氧化性

原花青素多以聚合物形式存在，本實(shí)驗(yàn)表明其抗氧化活性弱于其他5種黃酮類化合物，推測(cè)其空間結(jié)構(gòu)影響了抗氧化活性。

本實(shí)驗(yàn)采用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定6種黃酮類化合物清除O-2·的能力，此方法靈敏度高，快速測(cè)定，操作簡(jiǎn)單和重現(xiàn)性好，可用于評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化活性及抗自由基活性藥物的研究和篩選。研究結(jié)果表明，6種黃酮類化合物抗氧化活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，酚羥基是起抗氧化作用的必要基團(tuán)，B環(huán)的羥基化程度、羥基的數(shù)目和位置，C環(huán)開(kāi)環(huán)后形成的羥基和雙鍵，A環(huán)取代基的位置數(shù)目以及化合物的空間結(jié)構(gòu)，均是影響抗氧化活性的重要因素。

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Study of 6 flavonoids compounds for the scavenging superoxide anion free radical ability and the structure-activity relationships

ZHAO Jing1LI Yuqin2▲WANG Fangqiao2JIA Baoxiu2LIU Caihong2WANG Renliang3
1.Taishan Sanatorium of Shandong Province,Shandong Province,Tai'an271000,China;2.School of Pharmacy,Taishan Medical University,Shandong Province,Tai'an271016,China;3.School of Chemical Engineering,Taishan Medical University,Shandong Province,Tai'an271016,China

Objective To study the scavenging superoxide anion free radical(O-2·)ability of quercetin,myricetin,phloridzin,naringin,puerarin and proanthocyanidins,and to explore their structure-activity relationships for removing O-2·. Methods The scavenging O-2·ability was determined by flow injection analysis-pyrogallol-chemiluminescence.IC50was calculated and used to examine the scavenging free radical ability.Vitamin C was used as positive control.Results The results showed that IC50of quercetin,myricetin,phloridzin,naringin,puerarin and proanthocyanidins were 0.1547, 0.2048,0.4623,0.6157,1.8098,2.9798 μmol/L,respectively.The scavenging O-2·ability of the 6 compounds were arranged as quercetin,myricetin,phloridzin,naringin,puerarin and proanthocyanidins,and all were higher than Vitamin C(4.9586 μmol/L).Conclusion The scavenging O-2·ability of 6 flavonoids compounds have been closely related to their structures:phenolic hydroxyl is the necessary group for removing the O-2·,the degree of hydroxylation,the number and location of hydroxyl of B ring,the hydroxyl and double bond of the formatting of C ring opening,substituent position,number and spatial structure of A ring,are all important influencing factors of antioxidant activity.

Six flavonoids compounds;Superoxide anion free radical;The scavenging ability;The Structure-activity relationships

O657.3

A

1673-7210（2014）10（b）-0007-05

2014-07-12本文編輯：衛(wèi)軻）

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)ZR2011BL007）；泰山醫(yī)學(xué)院高層次課題培育計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)2013GCC05）。

趙靜（1970-），女，碩士；研究方向：中藥藥理學(xué)。

▲通訊作者