中溫淡鹽法制備低核酸酵母抽提物的工藝研究

王 斌， 黃麗娜， 邱麗娟

(1. 江門多微生物科技有限公司， 廣東 江門 529000；2. 廣東江門生物技術(shù)開發(fā)中心有限公司， 廣東 江門 529000)

食用酵母制品含有豐富的氨基酸、小分子肽類、呈味核苷酸和揮發(fā)性芳香化合物等，具有獨特的營養(yǎng)保健及調(diào)味特性，且不含膽固醇和脂肪酸，是一種已經(jīng)被認(rèn)可的天然安全健康食品。因一般酵母中RNA核酸含量較高，約6%～8%[1-2]，對于擔(dān)憂痛風(fēng)的人群，酵母的食用受到一定限制[3]。如何將高營養(yǎng)價值且天然安全的酵母開發(fā)使用到更廣泛的領(lǐng)域，制備低核酸的酵母抽提物將是一種方向。

近年來，一些研究人員對如何分離食物中特別是酵母及其蛋白分離物的核酸這一問題進(jìn)行了大量的研究，提出高壓放電(HVDE)和脈沖電場(PEF)處理[4]、酸處理、堿處理、酶處理、化學(xué)修飾、硅藻土-STE法和鹽析法等多種方法，這些方法存在對細(xì)胞物質(zhì)不同程度的損傷或不易產(chǎn)業(yè)化等問題。其中，采用酸堿工藝可獲得已去除96%核酸的脫核蛋白[5]，但產(chǎn)品功能性質(zhì)較差，經(jīng)堿處理后易產(chǎn)生對人體腎臟有害的賴丙氨酸。外酶處理生產(chǎn)工序較繁，需較昂貴的酶制劑，比較適合試劑盒提取酵母RNA的應(yīng)用[6]，內(nèi)酶處理時間長且收率低。化學(xué)修飾法則可能影響必需氨基酸的生物利用率[7]。硅藻土-STE法可獲得較純的RNA[8]，但制備分離蛋白不易產(chǎn)業(yè)化。鹽析法分離工藝簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn)，但由于鹽析法主要采取高溫(95～100℃)破壁、濃鹽提取RNA的工藝[9]，高溫易造成酵母胞內(nèi)熱敏性活性物質(zhì)(如B族維生素、SOD)等營養(yǎng)成分損失、風(fēng)味劣變等不良影響，降低產(chǎn)品功能；此外，濃鹽法提取率低，提取后的酵母菌體蛋白需經(jīng)二次分離洗滌去除殘留的鹽，增加生產(chǎn)成本。

針對上述存在問題，本文主要通過建立一種新的酵母核酸中溫淡鹽去除法，研究制備低核酸酵母抽提物，避免高溫對酵母活性物質(zhì)的破壞及保留產(chǎn)品風(fēng)味，且不需脫鹽處理，為開發(fā)應(yīng)用范圍更廣泛地優(yōu)質(zhì)酵母抽提物找到一種方便可行的產(chǎn)業(yè)化方法，為尿酸偏高及痛風(fēng)人群食用安全營養(yǎng)的酵母食品提供新的解決方案。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新鮮酵母乳液(RNA含量約為6%～8%)，氯化鈉、氫氧化鈉、乙酸乙酯、蛋白酶、β-葡聚糖酶。

1.2 主要儀器設(shè)備

KDN-102c自動定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；FE-20酸度計，梅特勒-托利多公司；MX-50水分測定儀，日本AND；LC-6M冷凍離心機(jī)，上海離心機(jī)械研究所；SHA-B恒溫振蕩水浴鍋，江蘇金壇億通電子有限公司；RE2002旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海博彩儀器設(shè)備有限公司；ZG真空干燥機(jī)600，常州市振興干燥設(shè)備廠。

1.3 檢測方法

1.3.1 酵母濃度分析：用水分測定儀測定。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量分析：凱氏定氮法[10]。

1.3.3 核酸含量分析：采用定磷法[11]。

1.3.4 核酸純度分析[12]：分別測定樣品在260nm處和280nm處的吸光度。如果A260/A280>2.0，說明樣品中部分核酸水解為核苷酸和堿基；如果A260/A280<2.0，說明樣品中蛋白質(zhì)含量較高，核酸純度不足。

1.3.5 核酸提取率計算公式：核酸提取率(%)

1.3.6 氨基酸態(tài)氮含量測定：甲醛滴定法[13]。

1.4 工藝路線

2 結(jié)果與討論

2.1 去除酵母核酸工藝條件研究

在不同pH值、溫度、質(zhì)壁分離劑等條件下，用正交試驗L16(45)考察10%酵母乳液提取1 h的效果，試驗結(jié)果見表1和表2。

表1 去除酵母核酸(RNA)正交試驗結(jié)果

表2 去除酵母核酸(RNA)正交試驗結(jié)果直觀分析

“*”為干基計。

從試驗結(jié)果可知，隨著pH值的升高，上清液中的核酸含量也隨之增高，這可能是由于微堿條件會水解酵母細(xì)胞壁的可溶性葡聚糖層，改變細(xì)胞壁的通透性，有助于核酸滲出[14-15]，但pH值并非越高越好，在強(qiáng)堿條件下大部分核酸會發(fā)生水解，不利于去除的核酸進(jìn)一步開發(fā)利用，降低核酸提取率及純度[16]，同時，強(qiáng)堿處理后的酵母蛋白風(fēng)味不佳。處理溫度對核酸去除率有明顯的影響，溫度越高，酵母細(xì)胞破壁效果越明顯，胞內(nèi)物質(zhì)釋出量也越多。在一些為提高胞內(nèi)物質(zhì)得率的研究中也發(fā)現(xiàn)，添加乙酸乙酯[14]、氯化鈉[17]及β-葡聚糖酶[18]等自溶促進(jìn)劑，或采取3段變溫自溶加酶法[19]，有利于破壞酵母細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，改變細(xì)胞膜的滲透性，促進(jìn)酵母胞內(nèi)內(nèi)容物尤其是核酸的析出，其中氯化鈉具有促進(jìn)核酸和蛋白質(zhì)解聚并使蛋白質(zhì)沉淀的效果[20]，從而提高核酸去除率。

由表1和表2綜合分析可知，各因素對酵母核酸去除效果影響的順序依次是pH值>溫度>β-葡聚糖酶>氯化鈉>乙酸乙酯。根據(jù)正交試驗結(jié)果確定中溫淡鹽處理方法，工藝方案為酵母濃度10%，pH值6.5，溫度60℃，添加3%食鹽、1.0%乙酸乙酯、2‰β-葡聚糖酶處理1 h。

2.2 比較兩種去除酵母核酸方法對制備RNA粗品的影響

表3 中溫淡鹽法與高溫濃鹽法制備RNA效果比較

“*”，干基計；“**”，高溫濃鹽法工藝：10%食鹽、95℃處理6 h，離心。

用高溫濃鹽法和中溫淡鹽法兩種工藝分別對酵母進(jìn)行處理，并離心脫核酸，將含核酸的上清液冷卻，并按以下工藝進(jìn)行RNA粗品的制備：在4000 r/min條件下離心10 min；將上清液用4 mol/L鹽酸調(diào)pH值至2.4，在4℃冰浴中靜置12 h后置于4000 r/min條件下離心10 min，獲得酵母核酸沉淀物；用95%乙醇洗滌核酸沉淀物，去除殘余的雜質(zhì)與色素[11]；通過真空干燥方式制成RNA粗品粉末。實驗結(jié)果見表3。

從表3可知，中溫淡鹽法較高溫濃鹽法在制備RNA粗品時，其核酸提取率提高了20.89%，核酸純度高。

2.3 低核酸酵母抽提物的制備

將經(jīng)過上述中溫淡鹽法處理離心脫核酸后的酵母液B，加水稀釋到10%濃度，作為試制樣，將經(jīng)過同樣工藝處理未離心脫核酸的酵母液A作為對照樣，各加入2‰蛋白酶及1.5‰風(fēng)味酶，于55℃、pH值6.5條件下酶解16 h。酶解液離心，上清液于55℃，-0.09 Mpa真空度下濃縮至可溶性固形物含量為60%～65%，制得酵母抽提物YE-B 及YE-A。實驗結(jié)果見表4。

表4 酵母抽提物理化指標(biāo)

*：以干基計。

從表4可知，經(jīng)脫核酸處理所制得的酵母抽提物YE-B，色淺、肉香味濃郁，且核酸含量(干基計)低至1.18%，比對照酵母抽提物YE-A的核酸(干基計)降低79.19%。制備的低核酸酵母抽提物YE-B其他指標(biāo)均符合酵母抽提物GB/T23530-2009國標(biāo)要求[21]。

3 小結(jié)

與高溫濃鹽法去除核酸的方法比較，本文研制的中溫淡鹽工藝，方法簡單，易產(chǎn)業(yè)化；不僅核酸去除率高，對核酸的深度開發(fā)利用更有利，由此制備的RNA粗品核酸純度也高；在去除核酸的過程中，未經(jīng)高溫破壁處理，有利于酵母內(nèi)的熱敏營養(yǎng)物質(zhì)的活性保全，其營養(yǎng)功能價值更高；外觀、口感及風(fēng)味是酵母抽提物用于調(diào)味品及營養(yǎng)休閑食品的重要感官指標(biāo)，本文研制的低核酸酵母抽提物產(chǎn)品，不需脫鹽處理，色香味均良好，適合在食品中的應(yīng)用。

低核酸酵母抽提物的成功開發(fā)，將促進(jìn)天然安全營養(yǎng)的酵母產(chǎn)品廣泛應(yīng)用，并為尿酸偏高及痛風(fēng)人群提供了新的優(yōu)質(zhì)食品。

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