腺苷A1受體基因多態(tài)性與浙南漢族人群部分性發(fā)作癲癇耐藥的相關(guān)性

徐惠琴，歐福勇，那仁·滿都拉，涂東佩，鄭榮遠，陳江帆，陳必成，陳玉軍

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325015；2.郴州市第一人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，湖南 郴州 423000；3.溫州醫(yī)科大學附屬眼視光醫(yī)院，浙江 溫州 325027；4.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 移植科，浙江 溫州 325015）

·論 著·

腺苷A1受體基因多態(tài)性與浙南漢族人群部分性發(fā)作癲癇耐藥的相關(guān)性

徐惠琴1，歐福勇2，那仁·滿都拉1，涂東佩1，鄭榮遠1，陳江帆3，陳必成4，陳玉軍1

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325015；2.郴州市第一人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，湖南 郴州 423000；3.溫州醫(yī)科大學附屬眼視光醫(yī)院，浙江 溫州 325027；4.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 移植科，浙江 溫州 325015）

目的：探討腺苷A1受體（A1AR）基因rs903361、rs10920573及rs3766553多態(tài)性與浙南漢族人群部分性發(fā)作癲癇耐藥的相關(guān)性。方法：選取120例部分性發(fā)作癲癇患者（癲癇耐藥組和非耐藥組各60例）及正常對照組（正常組）60例。采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP) 法檢測A1AR基因rs903361、rs10920573和rs3766553的多態(tài)性，并通過病例對照研究及l(fā)ogistic回歸分析方法分析其與癲癇耐藥的相關(guān)性。結(jié)果：所有入組人群三個位點等位基因C和T分布，正常組與非耐藥組三個位點各基因型分布差異均無統(tǒng)計學意義；耐藥組rs903361 CT型分布頻率低于非耐藥組（P=0.017），而rs10920573 CT型分布頻率高于非耐藥組（P=0.010），差異均具有統(tǒng)計學意義；rs3766553基因型分布各組差異均無統(tǒng)計學意義；rs903361 CC型、TT型耐藥的危險性分別為CT型的2.730倍和2.609倍，P值分別為0.043和0.047；rs10920573的CT型耐藥危險性為TT型的2.572倍（P=0.036）；rs903361 CC型、rs903361 TT型、rs10920573 CT型均為耐藥的獨立危險因素。結(jié)論：A1AR基因的rs903361 CC型、TT型和rs10920573 CT型為浙南漢族人群部分性發(fā)作癲癇耐藥產(chǎn)生的獨立危險因素。

多態(tài)性，單核苷酸；癲癇；耐藥；腺苷A1受體

癲癇是神經(jīng)科僅次于腦卒中的第二大常見疾病，主要通過藥物治療，現(xiàn)約有30%的患者表現(xiàn)為耐藥性癲癇。部分性發(fā)作癲癇作為人類最常見的癲癇類型，其耐藥性比例最高[1]。癲癇耐藥性的形成是一個多因素過程，其中與遺傳方面的因素密切相關(guān)[2]。腺苷是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元活動中起主要抑制作用的一個神經(jīng)調(diào)質(zhì)，可通過腺苷A1受體（adenosine A1 receptor，A1AR）抑制癲癇發(fā)作和發(fā)揮神經(jīng)保護等作用[3]。Wagner等[4]研究發(fā)現(xiàn)A1AR基因型變異可增加腦外傷后癲癇的發(fā)病率。由于腺苷系統(tǒng)的缺陷或功能改變都有可能加劇癲癇的發(fā)作，因此其可能成為部分癲癇患者耐藥的原因。為此筆者參考了Wagner等[4]研究中位點的選擇，分析A1AR基因rs903361、rs10920573及rs3766553多態(tài)性與部分性發(fā)作癲癇耐藥的相關(guān)性。

1 對象和方法

1.1 研究對象自2010年1月-2011年12月間溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科癲癇門診隨訪的部分性發(fā)作癲癇患者，且均已在本門診經(jīng)正規(guī)抗癲癇治療2年及以上，共120例。病例入選標準：①浙南漢族人；②年齡18～80歲；③經(jīng)臨床和腦電圖確診，依照1981年國際抗癲癇聯(lián)盟關(guān)于發(fā)作分類診斷標準診斷為部分性發(fā)作；④正規(guī)抗癲癇治療2年及以上者，且用藥劑量在有效范圍內(nèi)或已達常用最大劑量。排除標準：①有酒精相關(guān)性癲癇病史；②同時服用以下任何藥物：抗腫瘤藥物、細胞毒性藥物、類固醇化合物等；③患有嚴重器質(zhì)性病變?nèi)缛毖孕呐K病、肝腎功能不全等；④患有任何進展性疾病如腫瘤；⑤患有進展性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。耐藥組：符合王學峰等[5]關(guān)于耐藥性癲癇的診斷：經(jīng)正規(guī)抗癲癇治療后發(fā)作頻率仍為4次/月或以上者。非耐藥組：同等情況下，治療有效未發(fā)作達2年及以上。共收集耐藥組60例：女34例，男26例，年齡21～42歲，平均（31.5±10.32）歲；非耐藥組60例：女33例，男27例，年齡22～42歲，平均（32.02±9.91）歲；正常對照組（正常組60例）為性別、年齡與病例組匹配的同期健康體檢的隨機個體，其中男26例，女34例，年齡21～42歲，平均（31.48±10.23）歲。三組入選對象的籍貫均為浙江省南部地區(qū)，年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義。

1.2 主要試劑人全血基因組DNA提取試劑盒、Tap plus DNA Polymerase聚合酶套裝（北京天根生化科技有限公司），PCR引物（上海捷瑞生物科技有限公司），限制性內(nèi)切酶（Fermentas公司和New England Biolabs公司）。

1.3 方法

1.3.1 資料收集：記錄癲癇患者一般臨床資料及各種耐藥的可能危險因素，包括：性別、年齡、首次發(fā)作年齡、病程、發(fā)作類型、發(fā)作頻率、目前及既往用藥情況（用藥種類、劑量、開始服藥時間）、生產(chǎn)史、頭部外傷史、熱性驚厥史、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染史、家族史、腦部器質(zhì)性病變史、吸煙、飲酒史等。

1.3.2 實驗方法：采用人全血基因組提取試劑盒提取經(jīng)乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝處理的外周靜脈血DNA，應用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法進行基因分型，對含rs903361、rs10920573和rs3766553多態(tài)位點的基因片段進行PCR擴增，引物序列如下：rs3766553上游：5’-CAATCT AGCCAGCAGCCATC-3’，下游：5’-CGAGACAGACTTTAAGCA TCATCA-3’；rs903361上游：5’-GGGCAGAAAGTGAATGA GC-3’，下游：5’-CGGAAGTCCTCCCACGA-3’；rs10920573上游：5’-CAGCCTGGTCTCAAACTCC-3’，下游：5’-CCT TCTTGCCCGTGGTA-3’。分別采用限制性內(nèi)切酶ScaI、BsrI、Hpy166I進行酶切，瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后，紫外線凝膠成像儀判斷基因型并攝像。隨機抽取3個位點9種基因型共18例進行測序驗證。

1.4 統(tǒng)計學處理方法應用SPSSl8.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。采用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗樣本的群體代表性。多組計量資料之間比較依據(jù)方差齊性與否分別采用單因素方差分析或秩和檢驗。計數(shù)資料用x2檢驗或Fisher精確檢驗進行組間比較。采用多因素logistic回歸分析基因多態(tài)性與耐藥性相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 耐藥組與非耐藥組患者耐藥危險因素比較兩組患者臨床資料經(jīng)x2檢驗，結(jié)果顯示耐藥組熱性驚厥（x2=4.904，P=0.027）、發(fā)病至開始服藥時間≥1年（x2=4.848，P=0.028）的比例較非耐藥組偏高，差異具有統(tǒng)計學意義，其他臨床資料之間的差異無統(tǒng)計學意義，提示熱性驚厥和發(fā)病至開始服藥時間≥1年這兩項可能為耐藥性產(chǎn)生的危險因素，詳見表1。

表1 耐藥組和非耐藥組可能的耐藥危險因素比較[n=60，n（%）]

2.2 基因多態(tài)性分型

2.2.1 rs903361基因多態(tài)性：PCR擴增出612 bp長度的片段，酶切后可產(chǎn)生三種基因型，因6 bp片段太小，電泳后不可見。只有612 bp一條帶的為CC型，有372、234 bp兩條帶的為TT型，有612、372、234 bp三條帶的為CT型。見圖1。

圖1 rs903361位點PCR-RFPL酶切電泳圖

2.2.2 rs3766553基因多態(tài)性：PCR擴增出293 bp長度的片段，酶切后可產(chǎn)生三種基因型。因6 bp片段太小，電泳后不可見。只有293 bp一條帶的為TT型，有171、116 bp兩條帶的為CC型，有293、171、116 bp三條帶的為CT型。見圖2。

2.2.3 rs10920573基因多態(tài)性：PCR擴增出673 bp長度的片段，酶切后可產(chǎn)生三種基因型。酶切后337 bp和330 bp片段大小接近，二者融合成一條帶，6 bp片段太小，電泳后不可見。只有673 bp一條帶的為TT型，有337、330 bp兩條帶的為CC型，有673、337、330 bp三條帶的為CT型。見圖3。

圖2 rs3766553位點PCR-RFPL酶切電泳圖

圖3 rs10920573位點PCR-RFPL酶切電泳圖

2.3基因型和等位基因分布非耐藥組和正常組rs903361、rs10920573及rs3766553位點基因型頻率的分布，均符合Hardy-Weinberg平衡，說明該樣本具有良好的人群代表性。三組之間三個位點等位基因C和T的頻率分布、非耐藥組和正常組三個位點各基因型分布均無明顯差別。耐藥組rs903361 CT型分布頻率低于非耐藥組（x2=5.711，P=0.017），rs10920573 CT型分布頻率高于非耐藥組（x2=6.599，P=0.010），差異具有統(tǒng)計學意義。rs3766553基因型分布各組差異無統(tǒng)計學意義，詳見表2。

表2 部分性發(fā)作癲癇患者和正常組三個位點基因型和等位基因分布頻率比較[n=60，n（%）]

2.4 耐藥相關(guān)的危險因素logistic回歸分析結(jié)果

結(jié)合單因素分析結(jié)果，在平衡“熱性驚厥、發(fā)病至開始服藥間隔時間≥1年、首次發(fā)作年齡、性別、年齡” 5個危險因素后rs903361 CC型和TT型相對于CT型發(fā)生耐藥的危險度（OR）分別為2.730（95% CI：1.034～7.206，P=0.043）和2.609（95%CI：1.011～6.735，P=0.047），差異均存在統(tǒng)計學意義，提示rs903361 CC型和TT型均是耐藥性產(chǎn)生的獨立危險因素。而rs10920573 CT型相對于CC型和TT型發(fā)生耐藥的OR分別為1.834（95%CI：0.652～5.155，P=0.250）和2.572（95%CI：1.061～6.209，P=0.037），其中相對于TT型，差異存在統(tǒng)計學意義，提示rs10920573 CT型為耐藥產(chǎn)生的獨立危險因素。

3 討論

腺苷是大腦內(nèi)源性抗驚厥物質(zhì)，與癲癇發(fā)作的終止、嚴重程度及持續(xù)時間相關(guān)[6]。腺苷系統(tǒng)功能的缺陷，特別是腺苷發(fā)揮中樞抑制作用的主要受體A1AR的異常[7]，可加劇癲癇的發(fā)作，也可能成為部分患者耐藥的原因。腺苷及其受體激動劑、腺苷激酶抑制劑抑制癲癇發(fā)作的途徑，完全有別于現(xiàn)有抗癲癇藥的藥理機制，可能成為癲癇治療的新途徑，尤其對于耐藥性癲癇的治療可能會是一較大的突破。

Wagner等[4]研究發(fā)現(xiàn)A1AR基因rs10920573的CT型增加腦外傷后遲發(fā)型癲癇的發(fā)病率，rs3766553的TT型和CC型分別可增加早發(fā)及遲發(fā)型腦外傷后癲癇的發(fā)病率。在本研究中rs903361的CC、TT型和rs10920573 的CT型在部分發(fā)作性癲癇耐藥患者分布頻率明顯偏高，而rs3766553位點基因型各組之間未發(fā)現(xiàn)明顯差異。同時筆者收集了入選患者的相關(guān)臨床調(diào)查資料，經(jīng)多因素logistic回歸分析平衡各種耐藥相關(guān)的其他可能危險因素，發(fā)現(xiàn)A1AR基因rs903361的CC型、TT型和rs10920573 CT型是癲癇耐藥性發(fā)生的獨立危險因素。這一結(jié)果是目前有關(guān)A1AR基因變異與癲癇耐藥產(chǎn)生相關(guān)方面的初次探索。

rs903361、rs10920573、rs3766553均為A1AR基因的標簽單核苷酸（SNP tagging，tSNP），最小等位基因頻率都超過了20%。這3個tSNPs囊括了A1AR基因啟動子區(qū)域中5’上游的1 000 bp[4]。這些位點的遺傳變異均可能對A1AR的功能產(chǎn)生影響。rs903361為位于外顯子1附近的一個內(nèi)含子，最接近A1AR基因的5’上游啟動子區(qū)域。研究中純合的TT型和CC型均易致癲癇耐藥，相對于CT型耐藥的危險性為2.609倍和2.730倍，而雜合CT型則傾向于藥物治療有效。rs10920573位于內(nèi)含子4，其兩側(cè)為4個其他的內(nèi)含子單核苷酸[8]。而rs10920573 CT型相對于TT型耐藥的危險性為2.572倍，這與之前發(fā)現(xiàn)CT型增加腦外傷后癲癇的發(fā)病率結(jié)果[4]一致，因而這一結(jié)果對于耐藥性的產(chǎn)生有較強的提示意義。rs3766553標記A1AR基因一段大約有9 263 bp的DNA，覆蓋了最后一個外顯子，可能與受體配體結(jié)合和信號轉(zhuǎn)導都相關(guān)[9]。在之前的研究中認為rs3766553的TT型、CC型增加了腦外傷后癲癇的發(fā)病率[4]。然而本研究并未發(fā)現(xiàn)明顯的差異，也許與不同人群的選擇及樣本量較少有關(guān)。

A1AR高度表達于大腦皮層、海馬，是腺苷在中樞發(fā)揮抑制作用的主要受體亞型[3]。腺苷通過A1AR可抑制神經(jīng)突觸活動，介導癲癇發(fā)作的抑制和神經(jīng)保護等作用[6]。腦內(nèi)多種神經(jīng)遞質(zhì)，尤其是興奮性氨基酸，均可被神經(jīng)元突觸前的A1AR抑制[10]。無論在體外或體內(nèi)的癲癇模型中[11]，均發(fā)現(xiàn)A1AR介導的抗驚厥作用的缺失可易致癲癇持續(xù)狀態(tài)的發(fā)生。癲癇發(fā)作急性期可引起A1AR密度反應性的上調(diào)[12]，而慢性癲癇中伴隨著神經(jīng)元的損傷，A1AR水平明顯偏低[13]。

耐藥性癲癇患者往往表現(xiàn)為反復發(fā)作的慢性癲癇，很有可能伴隨A1AR水平的下降，而目前常規(guī)抗癲癇藥物作用缺乏針對腺苷作用缺失的藥物。因而若存在A1AR功能上的缺陷則可加劇癲癇的發(fā)作，且常規(guī)藥物治療無效。結(jié)合本研究結(jié)果，可推斷腺苷A1AR的遺傳變異有可能與部分發(fā)作性癲癇患者耐藥具有一定關(guān)系。

本研究的癲癇患者均來自溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院門診長期隨訪患者，在社會人群中的代表性有待于進一步驗證。由于本研究中對耐藥性癲癇的入選標準把握嚴格，故入選的每組病例僅為60例，病例數(shù)較少，因此說服力不強，希望在此基礎上進一步增加病例數(shù)，以期得到更可靠的結(jié)果。此外，本研究僅調(diào)查了內(nèi)含子區(qū)的幾個tSNP，病例對照研究也僅能提供相關(guān)的信息，因此，有待進一步的研究去證實該遺傳變異是如何影響A1AR功能而致使部分發(fā)作癲癇患者耐藥。

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（本文編輯：吳飛盈）

The association of adenosine A1 receptor gene variants with the multidrug-resistant partial seizure

epilepsy

XU Huiqin1, OU Fuyong2, NAREN Mandula1, TU Dongpei1, ZHENG Rongyuan1, CHEN Jiangfan3,

CHEN Bicheng4, CHEN Yujun1.1.Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Neurology, Chenzhou NO.1 People’s Hospital, Chenzhou,423000; 3.The Eye Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 4.Department of Transplantation, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To explore the association of the single-nucleotide polymorphisms (SNP) of adenosine A1 receptor (A1AR) gene with partial pharmacoresistance seizure in south of Zhejiang province Han population.Methods:One hundred and twenty cases of partial seizure patients were obtained for this study, multidrugresistant group and full controlled with no seizures group (followed: named the none pharmacoresistance group) each 60 cases, and 60 healthy patients as normal control group. A polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) was used for the detection of rs903361, rs10920573, rs3766553 SNP, via the retrospective case-control study and multiple logistic regression analysis methods to explore its correlation of drug resistance epilepsy. Rusults: Both the frequencies of the allelic of all SNPs among the three group and genotypes of three SNPs between the normal control and none pharmacoresistance group had no statistical difference. The frequency of rs903361 CT genotype in pharmacoresistance epilepsy patients was obviously lower than in the none pharmacoresistance group, P=0.017. The frequency of rs10920573 CT genotypes in pharmacoresistance epilepsy patients was obviously higher than in the none pharmacoresistance group, P=0.010. According to the multiple logistic regression analysis, the CC and TT genotypes in rs903361 were both the independent risk factor for pharmcoresistance in epileptic patients and associated with a 2.73 and 2.609 times added risk for pharmacoresistance than CT genotype, P=0.043 and 0.047 respectively. In rs10920573, CT genotype was also anindependent risk factor for pharmcoresistance in epileptic patients,and associated with a 2.572 times increased risk for pharmacoresistance than TT genotype, P=0.037. There was no difference among all rs3766553 genotypes.Conclusion:The CC and TT genotypes of rs903361 and the CT of rs10920573 are both the independent risk factors associated with mulltidrug-resistant partial seizure epilepsy.

polymorphism, single nucleotide; epilepsy; drug resistance; A1AR

R742.1

A

1000-2138（2014）02-0100-05

2013-03-27

溫州醫(yī)學院校外引進人才基金資助項目（QTJ11011）。

徐惠琴（1972-），女，浙江上虞人，副主任醫(yī)師，碩士。