白介素33對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞乏氧/復(fù)氧損傷時(shí)胞內(nèi)活性氧自由基生成的影響

李冠臻 張新超

.基礎(chǔ)研究.

白介素33對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞乏氧/復(fù)氧損傷時(shí)胞內(nèi)活性氧自由基生成的影響

李冠臻 張新超

目的 探討白介素33(IL-33)對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞乏氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用及胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)生成的影響。方法 分離培養(yǎng)SD乳鼠心肌細(xì)胞，將原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為單純對(duì)照(C)組、加藥對(duì)照(rIL-33 100 ng/ml，C1)組、乏氧/復(fù)氧(A/R)組、A/R+rIL-33(1、10、100 ng/m l)組，乏氧培養(yǎng)3 h后，復(fù)氧2 h。免疫組化鑒定心肌細(xì)胞；MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率；ELISA試劑盒檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)漏出率；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡(AV-PI雙標(biāo)法)、胞內(nèi)ROS生成量(ROS-DHE熒光探針)。結(jié)果 與C組相比，A/R組心肌細(xì)胞存活率明顯下降(P＜0.01)，LDH漏出顯著增高(P＜0.01)，凋亡率及胞內(nèi)ROS含量顯著增加(P＜0.01)；與A/R組相比，IL-33治療組劑量依賴性地提高細(xì)胞存活率(P＜0.01)，降低LDH漏出率、細(xì)胞凋亡率(P＜0.01)及胞內(nèi)ROS含量(P =0.03)；加藥對(duì)照組與C組相比，心肌細(xì)胞存活率、凋亡率、胞內(nèi)ROS含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論IL-33在心肌乏氧/復(fù)氧損傷過程中可以劑量依賴性地發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用，其保護(hù)作用機(jī)制可能與增強(qiáng)心肌抗氧化能力，減少胞內(nèi)ROS生成有關(guān)。

白細(xì)胞介素33； 活性氧； 肌細(xì)胞；心臟； 乏氧/復(fù)氧損傷

【Key words】Interleukin-33； Reactive oxygen species； Myocytes，cardiac； Anoxia/ reoxygenation-induced injury

近年研究顯示，重組白介素33(IL-33)可以對(duì)抗壓力過載導(dǎo)致的心功能障礙［1］，在動(dòng)物心肌梗死模型、心臟、肝臟缺血/再灌注模型及體外心肌細(xì)胞A/R模型中發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB，抑制血管緊張素Ⅱ及PKCβ/JNK通路［2-5］。在乏氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌凋亡過程中IL-33對(duì)胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)的影響，目前未見相關(guān)報(bào)道。本研究擬探討IL-33對(duì)抗體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞乏氧/復(fù)氧模型細(xì)胞凋亡、提高存活率的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)

健康1～3 d齡(雌雄不拘)SD乳鼠購于斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司。無菌條件下取心室肌，去鈣HBSS液(Gibco)漂洗殘血后，剪碎至1～2 mm3組織塊，用0.08%胰蛋白酶+0.03%Ⅱ型膠原酶(Gibco)37℃恒溫振蕩消化。收集除第一次外的細(xì)胞懸液，加入等體積預(yù)冷的含10%FBS (Hyclone)的DMEM培養(yǎng)液(Gibco)終止消化。4℃，1200 r/min離心10 min，棄上清。收集沉淀加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，經(jīng)200目細(xì)胞篩過濾去除組織塊，接種于50 ml培養(yǎng)瓶中。差速貼壁法(2 h)分離純化心肌細(xì)胞，24 h后換液，72 h后換無血清DMEM培養(yǎng)基同步化12 h備用。

1.2 心肌細(xì)胞乏氧/復(fù)氧模型的建立

乏氧/復(fù)氧模型的建立方法參照文獻(xiàn)［6］，將同步化12 h的心肌細(xì)胞棄掉原培養(yǎng)液，加入高濃度N2(99.9%，30 min)飽和的無血清DMEM培養(yǎng)液，放入低氧培養(yǎng)箱(SANYO MCO-18M)通入1%O2、5% CO2、94%N2，乏氧培養(yǎng)3 h后，更換含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，放入正常培養(yǎng)箱(95%空氣，5% CO2)中復(fù)氧2 h。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

參照文獻(xiàn)［2，7］，將原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為6組:單純對(duì)照(C)組、加藥對(duì)照(rIL-33 100 ng/m l)組、乏氧/復(fù)氧(A/R)組、A/R +rIL-33(1、10、100 ng/m l)組:A/R處理前30 min加入rIL-33(北京義翹神州生物技術(shù)有限公司Sino Biological Inc)。

1.4 心肌細(xì)胞鑒定

將培養(yǎng)48 h，搏動(dòng)良好的心肌細(xì)胞甲醇固定后，用小鼠單克隆抗α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白抗體(1∶100，α-SCA，武漢博士德生物工程有限公司)室溫孵育過夜，二抗用兔抗小鼠IgG(1∶5000，武漢博士德生物工程有限公司)孵育。心肌細(xì)胞α-SCA抗原表達(dá)陽性，胞漿呈棕黃色顆粒，胞核呈藍(lán)紫色。鏡下任選10個(gè)視野，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性率。

1.5 心肌細(xì)胞存活率測(cè)定

用過濾除菌的PBS(Gibco)溶解MTT(北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展有限公司)，終濃度0.5 mg/ml，參照試劑說明書，通過酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm吸光度值，計(jì)算心肌細(xì)胞存活率。

1.6 心肌細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)漏出率檢測(cè)

參照大鼠LDH檢測(cè)試劑盒(北京瑞爾欣德科技有限公司)說明書，復(fù)氧2 h后收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，4℃離心20 min(3000 r/min)后加入抗體包被的酶標(biāo)板中(10 μl/孔)，充分反應(yīng)后用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中大鼠LDH濃度。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率、胞內(nèi)ROS含量

0.125 %胰酶制備單細(xì)胞懸液，Annexin VFITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(北京寶賽生物技術(shù)有限公司)標(biāo)記細(xì)胞后進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)凋亡率。參照威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司ROS熒光探針-DHE說明書，流式細(xì)胞儀檢測(cè)胞內(nèi)ROS含量，熒光顯微鏡觀察ROS熒光顯色。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 乳鼠心肌細(xì)胞鑒定

倒置顯微鏡下可見培養(yǎng)48 h原代乳鼠心肌細(xì)胞有明顯搏動(dòng)，成簇生長(zhǎng)，呈多角形，折光性強(qiáng)(圖1A)。免疫組化鑒定:對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行α-SCA單抗組化染色，胞漿內(nèi)呈棕黃色陽性表達(dá)的細(xì)胞＞95%，非心肌細(xì)胞無陽性表達(dá)(圖1B)。

圖1 A:心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)48 h(×200)；B:心肌細(xì)胞α-SCA單抗免疫組化染色，可見胞漿內(nèi)呈棕黃色細(xì)顆粒狀陽性表達(dá)，胞核呈藍(lán)紫色(×400)

2.2 MTT法測(cè)定心肌細(xì)胞存活率

與對(duì)照組相比，A/R組細(xì)胞存活率明顯下降(n=9，P＜0.01)，IL-33明顯減輕A/R造成的細(xì)胞損傷，A/R+rIL-33(1、10、100 ng/ml)組細(xì)胞存活率較A/R組分別高11.4%、24.2%、32.9%(n=9，P＜0.01)；C1與C組之間細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

圖2 不同濃度IL-33對(duì)心肌細(xì)胞乏氧/復(fù)氧損傷細(xì)胞存活率的影響(ˉ±s)

2.3 心肌細(xì)胞LDH漏出水平

A/R組細(xì)胞LDH漏出水平較對(duì)照組顯著升高(11.65±0.22比8.32±0.18，P＜0.01)，與A/R組相比，重組IL-33組劑量依賴性地降低細(xì)胞LDH漏出水平，表明A/R刺激對(duì)心肌細(xì)胞造成了損傷，加入IL-33可以減少細(xì)胞損傷。C1與C組之間細(xì)胞LDH漏出水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 各組心肌細(xì)胞LDH漏出水平(±s，n=12)

表1 各組心肌細(xì)胞LDH漏出水平(±s，n=12)

注:與C組比較，aP＜0.01；與A/R組比較，bP＜0.01

組別LDH(IU/L)P值C組8.32±0.18 C1組8.34±0.21 0.883 A/R組11.65±0.22 0.001aA/R+rIL-33 1 ng/m l組9.39±0.31 0.005bA/R+rIL-33 10 ng/ml組8.75±0.27 0.001bA/R+rIL-33 100 ng/ml組8.54±0.09 0.001b

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞分析(AV-PI雙標(biāo)法)結(jié)果顯示，C組細(xì)胞凋亡率為(2.92%±0.74%)；A/R組細(xì)胞凋亡率為(27.62%±2.31%)，顯著高于C組(n=3，P＜0.01)；A/R+rIL-33(1、10、100 ng/ml)組細(xì)胞凋亡率分別為(20.69%±2.14%)、(14.54%± 1.79%)、(7.21%±1.90%)，明顯低于A/R組(n =3，P＜0.01)；C1細(xì)胞凋亡率為(3.05%± 0.82%)，與C組之間細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

圖3 不同濃度IL-33對(duì)心肌細(xì)胞乏氧/復(fù)氧損傷細(xì)胞凋亡率的影響(±s)

2.5 細(xì)胞內(nèi)ROS含量檢測(cè)

ROS-DHE(二氫乙啶，dihydroethidium)在胞內(nèi)可被ROS氧化形成氧化乙啶，在特定波長(zhǎng)激發(fā)下可產(chǎn)生紅色熒光。流式細(xì)胞儀檢測(cè)胞內(nèi)ROS含量，結(jié)果顯示:與C組相比，A/R組心肌細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著升高(n= 3，P＜0.01)。A/R+rIL-33(1、10、100 ng/ml)組ROS含量較A/R組顯著降低(n=3，P=0.03)；C1與C組之間細(xì)胞ROS含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

圖4 不同濃度IL-33對(duì)心肌細(xì)胞乏氧/復(fù)氧損傷胞內(nèi)ROS生成量的影響(×200)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過外加重組IL-33干預(yù)乳鼠心肌細(xì)胞乏氧/復(fù)氧損傷，首次證明了在此損傷過程中，IL-33可以通過抑制胞內(nèi)活性氧自由基生成，發(fā)揮抗心肌細(xì)胞凋亡作用，這可能成為IL-33抗心肌細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。

IL-33作為新近發(fā)現(xiàn)的白介素1家族成員ST2的內(nèi)源性配體，其在缺血性心臟疾病過程中的作用已成為近年來的研究熱點(diǎn)。我們的前期研究結(jié)果顯示，急性心肌梗死患者血清可溶性ST2水平升高可以作為獨(dú)立的預(yù)后評(píng)價(jià)因子［8］，為NT-proBNP及GRACE風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分提供補(bǔ)充信息，血清IL-33與可溶性ST2比值與急性心肌梗死患者6個(gè)月后的預(yù)后評(píng)估密切相關(guān)；與此同時(shí)，我們?cè)谖墨I(xiàn)報(bào)道中發(fā)現(xiàn)，IL-33是體內(nèi)細(xì)胞為應(yīng)對(duì)出血、機(jī)械負(fù)荷增加等刺激而分泌的一種細(xì)胞因子，在ST段抬高的心肌梗死患者中，升高的血清IL-33水平與患者死亡率密切相關(guān)［9］。IL-33在大鼠和小鼠實(shí)驗(yàn)中均可以對(duì)低氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞起保護(hù)作用，并且能夠增強(qiáng)心肌功能、增加存活率。近期研究證明，IL-33可以顯著降低胸主動(dòng)脈縮窄術(shù)后大鼠心肌間質(zhì)纖維化，改善心臟血管負(fù)荷；在大鼠心肌細(xì)胞體外乏氧培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，IL-33可以通過激活NF-κB、抑制血管緊張素Ⅱ及PKCβ/JNK通路而減少細(xì)胞凋亡［2-3］。另外，在大鼠體外和體內(nèi)試驗(yàn)中IL-33均可以增加抗凋亡蛋白家族(IAP)成員:X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)、程序性細(xì)胞死亡蛋白抑制因子1(cIAP-1)和survivin的分泌，誘導(dǎo)抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL表達(dá)，NF-κB可以增強(qiáng)IAP家族成員發(fā)揮促進(jìn)心肌細(xì)胞存活的作用［1］。由于細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程涉及多個(gè)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)及傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，目前關(guān)于IL-33對(duì)于心肌細(xì)胞抗凋亡的具體機(jī)制，尤其是氧化應(yīng)激過程的機(jī)制研究并不十分充分，因此，我們基于前期研究及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)IL-33在乏氧/復(fù)氧刺激介導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷機(jī)制進(jìn)行探索，通過分析胞內(nèi)ROS生成量及心肌損傷相關(guān)標(biāo)記物探索具體分子機(jī)制。

再灌注初期ROS爆發(fā)性生成是造成心肌氧化應(yīng)激的主要原因，氧化應(yīng)激可以進(jìn)一步觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)凋亡相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［10-11］。LDH是目前公認(rèn)的對(duì)心肌缺血損傷有診斷意義的糖酵解酶，在心肌細(xì)胞受到乏氧/復(fù)氧損傷時(shí)，心肌細(xì)胞內(nèi)磷脂酶激活，自由基釋放增加導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷從而引起心肌酶釋放增加［12］。本研究結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞經(jīng)A/R損傷后，LDH活性及胞內(nèi)ROS生成量顯著增加，外加重組IL-33可以劑量依賴性地降低LDH活性、抑制ROS生成，從而提高心肌細(xì)胞存活率，減少細(xì)胞凋亡，為IL-33的心肌細(xì)胞生物學(xué)保護(hù)效應(yīng)提供了新的線索。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，外加100 ng/ml的重組IL-33對(duì)體外正常培養(yǎng)的心肌細(xì)胞沒有明顯的影響，表明低劑量的(≤100 ng/ml)IL-33對(duì)心肌細(xì)胞的毒性作用是微不足道的。然而IL-33是否作為胞內(nèi)信使直接作用于凋亡信號(hào)通路以及高劑量的IL-33(＞100 ng/m l)對(duì)心肌細(xì)胞的作用還有待進(jìn)一步探索。

［1］Sanada S，Hakuno D，Higgins LJ，et al.IL-33 and ST2 comprise a critical biomechanically induced and cardioprotective signaling system［J］.J Clin Invest，2007，117:1538-1549.

［2］Seki K，Sanada S，Kudinova AY，et al.Interleukin-33 prevents apoptosis and improves survival after experimental myocardial infarction through ST2 signaling［J］.Circ Heart Fail，2009，2: 684-691.

［3］Rui T，Zhang J，Xu X，et al.Reduction in IL-33 expression exaggerates ischaemia/reperfusion-induced myocardial injury in mice with diabetes mellitus［J］.Cardiovasc Res，2012，94:370-378.

［4］Li S，Zhu FX，Zhang HB，et al.Pretreatment with interleukin-33 reduces warm hepatic ischemia/reperfusion injury in mice［J］. Chin Med J，2013，126:1855-1859.

［5］Rui T，Tang Q.IL-33 attenuates anoxia/reoxygenation-induced cardiomyocyte apoptosis by inhibition of PKCβ/JNK pathway［J］.PLoS One，2013，8:e56089.

［6］Zhang C，Lin G，Wan W，et al.Resveratrol，a polyphenol phytoalexin，protects cardiomyocytes against anoxia/ reoxygenation injury via the TLR4/NF-κB signaling pathway［J］. Int J Mol Med，2012，29:557-563.

［7］Zhu JW.Carver，Effects of interleukin-33 on cardiac fibroblast gene expression and activity［J］.Cytokine，2012，58:368-379.

［8］Zhang K，Zhang XC，Mi YM，et al.Predicting value of serum soluble ST2 and interleukin-33 for risk stratification and prognosis in patients with acute myocardial infarction［J］.Chin Med J，2013，126:3628-3631.

［9］Dhillon OS，Narayan HK，Khan SQ，et al.Pre-discharge risk stratification in unselected STEMI:is there a role for ST2 or its natural ligand IL-33 when compared with contemporary risk markers［J］？Int J Cardiol，2013，167:2182-2188.

［10］Baines CP，Molkentin JD.STRESS signaling pathways that modulate cardiac myocyte apoptosis［J］.J Mol Cell Cardiol，2005，38:47-62.

［11］Kleinbongard P，Heusch G，Schulz R.TNFalpha in atherosclerosis，myocardial ischemia/reperfusion and heart failure［J］.Pharmacol Ther，2010，127:295-314.

［12］Niu P，Shindo T，Iwata H，et al.Protective effects of endogenous adrenomedullin on cardiac hypertrophy，fibrosis，and renal damage［J］.Circulation，2004，109:1789-1794.

Influence of IL-33 on ROS generation in neonatal rats during anoxia/reoxygenation-induced myocardial injury

Li Guanzhen，Zhang Xinchao.
Department of Emergency，Beijing Hospital，Ministry of Health，Beijing 100730，China

Objective To investigate the protective effect of interleukin-33(IL-33)on anoxia/ reoxygenation(A/R)-induced injury and its influence on reactive oxygen species(ROS)generation in neonatal rats.M ethods Primary cardiomyocytes were isolated from neonatal Sprague-DawIey rats and were random ly divided into 6 groups:control group，control+rIL-33 100 ng/ml group，A/R group and A/R+ rIL-33(1，10，100 ng/ml)groups.A/R group and A/R+rIL-33 are subjected to 3 hours of anoxia，followed by 2 hours reoxygenation.Cardiomyocytes were identified by immunocytochemical staining.The viability of the cells was examined by MTT assay.The level of lactate dehydrogenase(LDH)was detected by a LDH enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)kit.The apoptosis of the cardiomyocytes was observed via flow cytometry(Annexin V and propidiom iodide double staining method)，ROS levels were measured by ROS fluorescent probe-dihydroethidium(DHE).Results Compared with control group，the apoptosis rate of the cardiomyocytes，level of LDH and ROS were remarkably increased(all P＜0.01)，the viability of cardiomyocytes was impaired significantly in A/R group(P＜0.01).Compared with A/R group，the apoptosis rate of the cardiomyocytes(P＜0.01)，level of LDH and ROS production(P=0.03)were significantly decreased(P＜0.01)，and the viability of cardiomyocytes enhanced significantly in rIL-33(1，10，100 ng/ml)groups in a dose-dependent manner(all P＜0.01).There was no significant difference between control group and control+rIL-33 100 ng/m l group.Conclusions IL-33 prevents apoptosis and improves survival during the anoxia/reoxygenation-induced cardiomyocyte injury，which may be due to the effects of anti-oxidative mechanism and reduce ROS generation.

Zhang Xinchao，Email:xinchaoz@163.com

2013-12-09)

(本文編輯:周白瑜)

10.3969/j.issn.1007-5410.2014.02.015

100730衛(wèi)生部北京醫(yī)院急診科

張新超，電子信箱:xinchaoz@163.com