大豆多糖對(duì)環(huán)磷酰胺抗腫瘤作用的減毒增效機(jī)制研究

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(1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心生物安全評(píng)價(jià)研究所,國(guó)家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心,黑龍江哈爾濱 150076; 2. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150076; 3. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品加工研究所,黑龍江哈爾濱 150086)

《本草綱目》記載,大豆有涂癰腫、逐水脹、長(zhǎng)肌膚、填骨髓等作用。從豆渣中提取的可溶性大豆多糖具有許多生物學(xué)功能,目前主要用于食品行業(yè)的研究與應(yīng)用,本課題組經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)大豆多糖能增強(qiáng)荷瘤小鼠B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的免疫功能,調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[1 - 2]。且大豆多糖為植物中提取的活性物質(zhì)本身無(wú)毒、安全,有一定的生物學(xué)作用[3 - 5]。

環(huán)磷酰胺為臨床常用的廣譜抗腫瘤藥物,由于其對(duì)造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的毒副作用不利于機(jī)體的繼續(xù)治療與術(shù)后的恢復(fù)[6 - 8],已有研究表明大豆多糖能通過(guò)提高機(jī)體免疫力,起到抗腫瘤作用,本研究將大豆多糖和環(huán)磷酰胺聯(lián)合應(yīng)用,腋下接種S180肉瘤的KM小鼠為載體,研究其對(duì)荷瘤機(jī)體免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)的影響,以期既能夠開(kāi)發(fā)臨床抗腫瘤輔助用藥,又能為環(huán)磷酰胺的安全使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

昆明種小鼠,18 ～ 22g,雌、雄各半 由長(zhǎng)春高新醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供;肉瘤S180購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院;大豆多糖(純度95%) 上海百奧特植物蛋白科技有限公司;環(huán)磷酰胺(CP) 江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司;Anti - mouse - FITC - CD4單克隆抗體、Anti - mouse - PE - CD8單克隆抗體 美國(guó)ebioscience公司;小鼠腫瘤壞死因子 - αELISA 檢測(cè)試劑盒 美國(guó)R&D公司等。

ALC - 110. 4型萬(wàn)分之一電子天平 德國(guó)Sartorius Group;LD4 - 2A型臺(tái)式低速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠(chǎng);普通光學(xué)顯微鏡 Leica公司;SUNRISE 酶標(biāo)儀 TECAN公司;EPICS - XL - MCL流式細(xì)胞儀 美國(guó)Beckman - Coulter公司等。

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法

1. 2. 1 動(dòng)物分組與給藥 昆明種小鼠50只,將接種8d的S180肉瘤腹水5mL,生理鹽水1∶ 3稀釋,0. 2mL/只接種于小鼠右前肢腋下。24h后隨機(jī)分成5組,每組10只,雌雄各半。從接種第二天開(kāi)始,分別腹腔注射給藥,分為陰性對(duì)照組:同體積生理鹽水;環(huán)磷酰胺(CP)對(duì)照組:25mg/(kg·d);大豆多糖(soybean polysaccharide,SPS)聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療組A:CP 25mg/kg·d+SPS 50mg/kg·d、B:CP 25mg/(kg·d)+SPS 100mg/(kg·d)、C:CP 25mg/(kg·d)+SPS 200mg/(kg·d);給藥量為0. 2mL/只/d,連續(xù)給藥10d,停藥次日處死動(dòng)物。

1. 2. 2 白細(xì)胞懸液制備 停藥次日,試管內(nèi)加2%的乙酸0. 38mL,取0. 02mL尾靜脈血,充分裂解紅細(xì)胞,顯微鏡下觀(guān)察外周血白細(xì)胞數(shù)量。

1. 2. 3 脾淋巴細(xì)胞制備 收集脾細(xì)胞于離心管中,以1500r/min離心10min。10倍體積0. 83%的NH4Cl溶液重懸,靜置4min,裂解紅細(xì)胞,1000r/min離心5min得白細(xì)胞液。Hanks液洗,pH為7. 2 ～ 7. 4的PBS稀釋細(xì)胞成1×106個(gè)/mL。

1. 2. 4 小鼠血清中TNF - α的檢測(cè) 眼球取血,1000r/min離心10min,取50μL加生物素標(biāo)記抗體50μL。37℃溫育1h。加親和鏈酶素 - HRP 60μL,37℃溫育30min。每孔加入底物A和底物B各50μL,37℃溫育10min。450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。以TNF - α標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X),相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),并計(jì)算各樣品中的TNF - α含量。

1. 2. 5 T淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定 取1×106個(gè)細(xì)胞1mL,2000r/min離心5min,分別加入熒光標(biāo)記的抗小鼠CD4、CD8的單克隆抗體各100μL,同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組和單加CD4、CD8抗體的對(duì)照組。4℃避光30min,加1mL PBS緩沖液洗滌,2000r/min離心5min,1% 多聚甲醛1mL固定30min,200目過(guò)濾,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 大豆多糖聯(lián)合環(huán)磷酰胺對(duì)S180荷瘤小鼠外周血中白細(xì)胞數(shù)量的影響

由表1可以看出,環(huán)磷酰胺顯著(p<0. 01)降低了荷瘤小鼠血液中的白細(xì)胞數(shù)量,與環(huán)磷酰胺組相比,大豆多糖各劑量組白細(xì)胞數(shù)量均有極顯著(p<0. 01)上升。

表1 大豆多糖聯(lián)合環(huán)磷酰胺對(duì)S180荷瘤小鼠外周血中白細(xì)胞數(shù)量的影響Table 1 The effect of SPS with CP on WBC of mice

注:與對(duì)照組比較*p<0. 05,* *p<0. 01;與CP比較#p<0. 05;##p<0. 01。

2. 2 大豆多糖聯(lián)合環(huán)磷酰胺對(duì)S180荷瘤小鼠血清中TNF - α含量的影響

TNF - α標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程:y=0. 002x+0. 118,R2=0. 993

圖1 TNF - α標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig. 1 Standard curve of TNF - α

如表2所示,與對(duì)照組相比,環(huán)磷酰胺組TNF - α水平下降,差異極顯著(p<0. 01),聯(lián)合用藥各劑量組TNF - α含量均有所提高,其中低劑量組統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)意義(p>0. 05),中、高劑量組有極顯著性差異(p<0. 01)。與環(huán)磷酰胺組比較,低劑量組有差異(p<0. 05),中、高劑量組有極顯著性差異(p<0. 01)。

2. 3 大豆多糖聯(lián)合環(huán)磷酰胺對(duì)S180荷瘤小鼠 T 淋巴細(xì)胞亞群的影響

表2 大豆多糖聯(lián)合環(huán)磷酰胺對(duì)S180荷瘤小鼠血清TNF - α含量的影響Table 2 The effect of SPS with CP on TNF - α in serum of mice with tumor

圖2 大豆多糖聯(lián)合環(huán)磷酰胺對(duì)S180荷瘤小鼠T淋巴細(xì)胞亞群作的影響Fig. 2 The effect of SPS with CP on and of T lymphocyte subsets注:a:對(duì)照組;b:環(huán)磷酰胺組;c:低劑量組;d:中劑量組;e:高劑量組。

3 討論

腫瘤治療主要根據(jù)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞不同的代謝特征、生物學(xué)特征、基因特征進(jìn)行的,如果只強(qiáng)調(diào)治療腫瘤的個(gè)性,忽視共性和整體原則就會(huì)影響治療效果。如化療及放療藥物在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也損壞機(jī)體的免疫功能,使殘存的腫瘤細(xì)胞急劇繁殖,影響治療效果。臨床觀(guān)察表明惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展,患者對(duì)治療措施的療效和存活期與機(jī)體的免疫狀態(tài)有密切關(guān)系。因此通過(guò)提高機(jī)體的免疫功能增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤作用的治療方法也越來(lái)越重要。天然多糖作為免疫調(diào)節(jié)劑由于本身對(duì)機(jī)體的毒副作用小,增強(qiáng)機(jī)體免疫力等優(yōu)點(diǎn)受到人們的密切關(guān)注[9]。 造血系統(tǒng)是體內(nèi)高度活躍和高度新陳代謝的系統(tǒng),由于血細(xì)胞的生成主要是在骨髓造血組織中進(jìn)行,因此血細(xì)胞的變化能夠一定程度的反映骨髓造血系統(tǒng)的變化。環(huán)磷酰胺可導(dǎo)致機(jī)體外周血白細(xì)胞數(shù)量減少,T細(xì)胞異?；罨?使免疫功能低下,是化療藥物骨髓抑制的表現(xiàn)[10]。TNF - α能夠引起腫瘤組織血管損傷和血栓形成,繼而使腫瘤組織發(fā)生出血、壞死,并能夠促進(jìn)T細(xì)胞及其它殺傷細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。

4 結(jié)論

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