結直腸癌肝轉移相關的分子標志物

陳婧，何友吉

(東南大學醫(yī)學院 微生物與免疫學系，江蘇 南京 210009)

結直腸癌已發(fā)展成為中國第五大癌癥殺手[1]，遠處轉移是結直腸癌患者的主要死因，40%～50%的患者在原發(fā)灶切除后發(fā)生肝轉移。不可手術的肝轉移患者盡管有靶向藥物的使用，其中位生存期仍不超過2年。因此，盡早發(fā)現(xiàn)肝轉移對于判斷結直腸癌患者的預后以及是否需要采取干預措施至關重要。

腫瘤細胞的浸潤和轉移是一個復雜的過程。腫瘤轉移的“宿命論”認為，決定腫瘤生物學行為及臨床表型的遺傳學改變在原發(fā)腫瘤中已經(jīng)存在[2]，該學說已被Van’t Veer等用芯片技術在乳腺癌的原發(fā)灶中證實[3]。

在結直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，肝轉移灶中的DNA拷貝數(shù)譜及基因表達譜與其原發(fā)灶高度相似，與上述“宿命”模型一致[4- 5]，表明從結直腸癌的原發(fā)灶出發(fā)能夠找出預測其肝轉移的生物學指標。在對結直腸癌組織和細胞株展開的大量分子和細胞遺傳學研究中發(fā)現(xiàn)，結直腸癌的發(fā)展有明確的病理階段，每個階段有特異的癌/抑癌基因的突變[6]。這些改變發(fā)生的關鍵機制是基因組的不穩(wěn)定，可歸納為兩種方式：由DNA錯配修復缺陷導致的微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability， MIN or MSI)，僅占15%，其腫瘤細胞通常保持正常的二倍體狀態(tài)；另一種則是在染色體水平上呈現(xiàn)的基因組不穩(wěn)定性，即由于染色體不穩(wěn)定(chromosomal instable，CIN)而產生非整倍體(aneuploidy)的變化，占85%。

本文中作者對目前正在從染色體、基因、蛋白等各水平尋找與結直腸癌肝轉移相關分子標志物的文獻進行綜述。

1 與結直腸癌肝轉移相關的染色體變異

基于現(xiàn)有aCGH(array comparative genomic hybridization)和SNP(single nucleotide polymorphism)的研究，結直腸癌中常被報道的染色體改變包括7， 8q， 13q 和20q的擴增及4， 8p，14q， 15q， 17p 和18q的缺失[7- 9]，現(xiàn)已證實DNA拷貝數(shù)的變化發(fā)生在特定模式下，并與不同的臨床表現(xiàn)相關[10- 12]。

目前SNP芯片的分辨率已經(jīng)能夠檢測到染色體上小于2.5kb有變異的區(qū)域，Sayagues J.M等用高分辨率的SNP(500K)檢測了23例肝轉移患者的原發(fā)灶，發(fā)現(xiàn)7， 8q，11q，13q，20q和X的擴增以及1p， 8p， 17p，18q的缺失最為常見。該研究認為，在變異染色體中4種重現(xiàn)的斷裂點位于1p1，8p12，17p11.2，20p12.1，又以17p11.2最為多見[13]。

采用FISH、aCGH技術，以發(fā)生肝轉移和未發(fā)生轉移或肝外臟器轉移的原發(fā)性結直腸癌為標本進行比較，發(fā)現(xiàn)肝轉移患者原發(fā)灶中染色體變化最為明顯的是20q，其擴增倍數(shù)明顯高于未發(fā)生肝轉移組[5，14]，還有一部分染色體的變化表現(xiàn)為8q的擴增及18q的缺失[5，15]。

2 變異的染色體上與結直腸癌肝轉移相關的候選基因(蛋白)

2.1 鋅指蛋白 217(ZEN217)

原癌基因ZEN217定位于20q13.2，被認為是有可能驅動20q13擴增的靶分子。在結直腸癌肝轉移灶中，ZEN217出現(xiàn)擴增的頻率明顯高于原發(fā)灶，未發(fā)生肝轉移的患者其原發(fā)灶未出現(xiàn)該基因的多拷貝，提示ZEN217的擴增增加了結直腸癌肝轉移的風險[16]。

2.2 細胞凋亡易感蛋白(chromosome segregation 1- like，CSE1L)

定位于20q13.13，編碼一種輸出蛋白，介導經(jīng)典核定位信號(NLS)通路中輸入蛋白-α的回收[17]。研究發(fā)現(xiàn)CSE1L/CAS的mRNA在腫瘤細胞中表達高于正常腺體細胞，該基因被干擾后結直腸癌細胞黏附能力下降，凋亡比例增加。免疫組化的方法顯示，CSE1L/CAS在結直腸癌細胞胞質中的高表達與高TNM分期及浸潤深度相關，高表達CSE1L/CAS的結腸癌細胞系HT- 29具有向肝臟轉移的高風險，5/7的小鼠在注射HT- 29后出現(xiàn)肝臟轉移灶而無其他臟器轉移，提示該蛋白參與了結直腸癌細胞的肝轉移過程[18]。

2.3 轉錄因子 E2F- 1

多種腫瘤細胞經(jīng)常高表達轉錄因子E2F1[19]，基因定位于20q11.2， E2F1游離化后活化S期相關蛋白?，F(xiàn)認為，E2F1活性的調節(jié)紊亂是腫瘤形成過程中的一個始發(fā)事件。通過芯片技術發(fā)現(xiàn)了越來越多的E2F1的靶分子，這些分子本身或它們作用的次級蛋白可能在轉移過程中發(fā)揮了作用。Marian等用CGH及q- PCR的方法發(fā)現(xiàn)，結腸癌肝、肺轉移灶中20q有普遍的擴增(16/18)，而E2F1拷貝數(shù)目在肝、肺轉移灶中均值為4.1、3.9，在原發(fā)灶中的拷貝數(shù)為2.52[20]。

2.4 結直腸癌缺失蛋白(DCC)

定位于18q21.2，是公認的抑癌基因，編碼一種穿膜蛋白，表達于大部分正常組織以及腸黏膜上，參與細胞- 細胞以及細胞- 基質間的相互調節(jié)，影響細胞生長、分化及轉移的發(fā)生[21]。18號染色體的缺失在腺瘤向浸潤性腫瘤的發(fā)展過程中呈上升趨勢[22]，DCC被認為是這種雜合性缺失的靶基因。原發(fā)灶中DCC的缺失與患者的預后不良相關[23]，并可作為結直腸癌遠處轉移的預測指標，雖然這種預測的敏感性可能與患者的分期相關，在所有患者中敏感性為42%，特異性為71%，在Ⅱ期患者中陽性預測值為19%，陰性預測值為88%[24]。

2.5 Smad4(DPC4)

定位于18q21.1，該基因產物是TGF-β信號通路中介導細胞生長和發(fā)育相關的中間產物，Smad4與Smad2、Smad3形成一種復合物作用于細胞核上，并在此激活TGF-β轉錄過程中的多個相關基因[25]。已有多篇文獻報道，Smad4表達的變化更多出現(xiàn)在進展性結直腸癌以及轉移性結直腸癌中。免疫組化的方法顯示，轉移灶比原發(fā)灶更易發(fā)生Smad4缺失，肝轉移灶比肝外轉移灶的缺失更易發(fā)生[26]，當給Balb/c小鼠注射CT26- Smad4下調的細胞系時，小鼠發(fā)生肝轉移的風險增加且小鼠肝轉移灶的重量明顯高于對照組，發(fā)生肝轉移的小鼠平均生存時間明顯低于對照組(26dvs44.5d)，說明Smad4能夠抑制CT26在體內的肝轉移傾向[27]。

2.6 MMP- 7(matrilysin、pump- 1)

定位于11q21- q22，負責正常情況下細胞外基質重塑及病理性的基底膜及基質的破壞。研究表明，攜帶有MMP- 7轉導子的細胞在SCID小鼠體內更加具備向肌層侵襲及向肝臟轉移的能力，轉移灶中MMP- 7前體蛋白(pro- MMP7)表達高于正常肝組織[28]。有研究指出，入院時診斷有肝轉移患者的MMP- 7陽性率(72%)高于5年后發(fā)生肝轉移的患者(47%)，所有轉移組患者原發(fā)灶MMP- 7的表達明顯高于未發(fā)生轉移組的患者，并且這種轉移以淋巴循環(huán)途徑居多[29]。新近研究指出，患者血清中MMP- 7水平與患者年齡、腫瘤直徑及遠處轉移相關[30]。

2.7 PRL- 3(PTP4A3)

定位于8q24.3，編碼一種位于細胞膜表面的酪氨酸磷酸酶，22kD。Saha等應用人基因表達系列分析(SAGE)首次證實，PRL編碼的蛋白高表達于結直腸癌的肝轉移灶，而幾乎不表達于正常大腸上皮細胞表面，弱表達于腺瘤以及原發(fā)灶組織中[31]。Bardelli等擴大了轉移灶的檢測范圍，發(fā)現(xiàn)PRL- 3只高表達于結直腸癌的大部分轉移灶(肝、肺、腦、淋巴結)，而不在其他癌癥的肝轉移灶和原發(fā)灶中高表達，且這種高表達不源于基因的擴增[32]。Kato等證實PRL- 3基因在結直腸癌細胞肝轉移的過程中所扮演的角色是增強細胞的活動性，敲除該基因后細胞的活動性及在肝臟形成的克隆明顯減少[33]。也有報道認為它不僅能破壞原血管的基底層有助于腫瘤細胞的擴散，并能在轉移灶有助于異常新血管的生成[34]。

2.8 NDRG1

NDRG1(cap43/rit42/RTP/Drg1/TDD5)是第一個被證實的轉移抑制因子，位于8q24.2，NDRG1的過度表達能夠明顯抑制腫瘤細胞的轉移能力，當給無胸腺的小鼠注入過量表達NDRG1的細胞系SW620后發(fā)現(xiàn)，只有23%的小鼠發(fā)生了肝轉移而對照組有75%發(fā)生了肝轉移[35]。SW480和SW620是來源于同一患者但轉移能力不同的兩株細胞系(SW620轉移能力強)，當SW480細胞中的NDRG1基因被干擾后，其表型及轉移能力均向SW620接近[36]。

2.9 C- Met

定位于7q21- 31，編碼一種跨膜糖蛋白，與肝細胞生長因子/擴散因子(HGF/SF)結合[37]，可使細胞進入有絲分裂及抗凋亡程序[38]。C-Met編碼的蛋白在血管重塑、細胞運動性能提高、生長、侵襲、分化、遷移發(fā)揮作用[38- 40]。Zeng等用PCR- LDR/FISH的方法發(fā)現(xiàn)，C- Met基因拷貝數(shù)目的增加在結直腸癌的原發(fā)灶中是一件小概率事件(9/247)，但原發(fā)灶中C- Met基因拷貝數(shù)目增加的患者發(fā)生肝轉移的概率較高(6/9)，同時這類患者腫瘤細胞的浸潤程度較深[41]。

2.10 CCR(chemokine receptor)

在Ghadjar等的研究中發(fā)現(xiàn)，CCR6在原發(fā)灶組織中表達雖不盡相同，但高表達CCR6的患者發(fā)生肝轉移的概率(9/11)要遠高于低表達CCR6的患者(2/21)，在多重回歸分析中控制性別、年齡、病理分級等相關因素后，原發(fā)灶中CCR6的高表達可以作為預測肝轉移的獨立因子[42]，該基因定位于6q27。

3 血清中與結直腸癌肝轉移相關的指標

3.1 miRNA

miRNA是長度為18～22的非編碼核糖核苷酸片段，通過干擾轉錄或抑制翻譯過程來調節(jié)靶基因的表達[43]。盡管miRNAs的數(shù)目在不斷增加，但是只有少數(shù)miRNA具有原癌或抑癌基因的作用，并參與腫瘤的發(fā)病機制[44]。Cheng等用qPCR的方法在中國的Ⅰ～Ⅲ期結直腸癌患者中發(fā)現(xiàn)，血漿中高濃度的miR- 141與結直腸癌患者的遠處轉移相關，但與淋巴結轉移無關[45]。Wang等用qPCR方法發(fā)現(xiàn)，結直腸癌肝轉移患者外周血中miR- 29a含量高于未發(fā)生肝轉移的患者，該標志物對于區(qū)分肝轉移的敏感性達到75%[46]。

3.2 REG- Ⅳ

REG- Ⅳ定位于1p13.1- p12，編碼的REG- Ⅳ屬于鈣依賴性凝集素超家族成員及EGFR/Akt/激活蛋白- 1信號通路的有效激活劑。用qPCR的方法證實，大于70%的結直腸癌患者體內均顯示REG- Ⅳ表達上調[47- 48]。Oue等用免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)，發(fā)生肝轉移的結直腸癌患者REG- Ⅳ表達明顯高于未發(fā)生肝轉移的患者，隨后ELISA的方法證實肝轉移患者血清中REG- Ⅳ高于無肝轉移的患者[49]。

上述可在血清中檢測的新型指標還需要更多更大的基礎實驗及臨床實驗的驗證才能推廣到臨床,目前在臨床應用的廣譜血清指標為CEA，雖然它能夠提示腫瘤的發(fā)生，但是缺乏足夠的及時性與敏感性。

4 基因突變

結直腸癌中最常見的體細胞突變位于PI3K/RAS- RAF信號通路中，通過PIK3CA、KRAS和BRAF基因的突變使得該通路達到過度活化的狀態(tài)。這些突變的頻率和熱點在西方結直腸癌患者中已經(jīng)明確，更多的研究傾向于它們的狀態(tài)與患者對靶向治療藥物的敏感性及患者預后的研究。它們與肝轉移發(fā)生的負相關性只在Bruin 等的研究中被報道，顯示攜帶有20q擴增且無突變患者肝轉移發(fā)生率高達61%，是其他患者肝轉移發(fā)生率的3倍。因此，他們認為聯(lián)合檢測結直腸癌原發(fā)灶中20q擴增和PI3K信號通路基因突變可以很好地預測患者手術后發(fā)生肝轉移的風險[50]。與此觀點類似，新近有研究認為RAS基因突變能夠預測結直腸癌肺轉移的發(fā)生，但不能預測肝轉移，肝轉移患者中KRAS基因的突變頻率低于其在結直腸癌患者中普遍公認的頻率30%～40%，這從側面說明了KRAS突變與肝轉移的負相關性[51]。

5 表觀遺傳學指標

正如基因突變的發(fā)生，表觀遺傳學指標的改變也能推進結直腸癌病程的發(fā)展，在結直腸癌中研究得最為廣泛的是DNA的異常甲基化，約有20%的結直腸癌患者表現(xiàn)為CIMP表型[52]。結直腸癌進程中常見的甲基化基因已被歸納總結[53]。Ju等用焦磷酸測序方法在53例Ⅰ～Ⅲ期、25例Ⅳ期及62例肝轉移患者中發(fā)現(xiàn)，超過80%Ⅳ期及肝轉移患者攜帶MGMT甲基化，部分肝轉移患者攜帶TIMP3甲基化。CIMP陽性的患者出現(xiàn)復發(fā)及肝轉移的時間要早于CIMP陰性的患者，TIMP3甲基化在肝轉移組出現(xiàn)的頻率(15.5%)明顯高于Ⅰ～Ⅲ(3.8%)及Ⅳ期(0%)非肝轉移患者。接下來作者利用MCAM發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)基因在原發(fā)灶和肝轉移灶中甲基化狀態(tài)一致，而UPK3A只在轉移灶中表現(xiàn)為甲基化狀態(tài)，作者認為在原發(fā)灶及轉移灶表達不一致的基因才有可能在轉移過程中發(fā)揮作用，所以該基因很有可能參與了肝轉移的過程[54]。

綜上所述，結直腸癌的肝轉移是一個極為復雜的生物學過程，涉及到了多種遺傳學及表觀遺傳學特征的改變，迄今還沒有完善的評估指標。并且上述提及的預測模型只在西方患者中適用，國內尚無相關報道，但研究者們已經(jīng)注意到了結直腸癌患者中染色體變異情況的普遍性，且20q的擴增是最常見的染色體變異之一[55- 57]。在結直腸癌肝轉移這個多維化的變化過程中， 我們希望從不同的角度、不同的分子水平來找到更多與此過程相關的信息，最終將這樣的信息轉化為臨床檢測手段，來為結直腸癌患者提供更多的治療指導。

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