磁性微球在細(xì)胞與生物大分子分離純化中的應(yīng)用

崔夢(mèng)楠，田 偉，馬素娟，李明生，馬忠仁，馮玉萍＊

（1.甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730030；2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030；3.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050）

磁分離技術(shù)是以具有超順磁性的磁性微球?yàn)楣滔噍d體，通過(guò)表面功能基團(tuán)特異性吸附及解吸附，在外加磁場(chǎng)作用下分離目標(biāo)產(chǎn)物的一種新型分離技術(shù)［1］。在磁場(chǎng)條件下，磁性微球能夠穩(wěn)定的懸浮在溶液體系中，其超順磁性能夠快速的使固液分離，而省去傳統(tǒng)分離中離心過(guò)濾等繁瑣操作，同時(shí)還可以提高分離過(guò)程中反應(yīng)物之間相互作用的動(dòng)力學(xué)速度。另外，磁性微球由于比表面積大，表面可偶聯(lián)的配基容量也大，因而通過(guò)共聚、球表面改性后可賦予多種活性功能基團(tuán)（-COOH、-COH、-NH2等），快速且特異地結(jié)合酶、細(xì)胞、抗體等生物活性物質(zhì)［2］。因此，磁分離技術(shù)在生物分離純化領(lǐng)域有著廣闊的研究和應(yīng)用前景。

磁分離技術(shù)在生物分離領(lǐng)域中的應(yīng)用首先由Robinson P J等［3］提出，將纖維素磁性微球用于酶的固定化。隨后的20年，磁性微球在生物分離領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)展緩慢。進(jìn)入21世紀(jì)后，磁分離技術(shù)開(kāi)始迅速發(fā)展，并在Ugelstad J等［4］研究基礎(chǔ)上相繼開(kāi)發(fā)了一系列的商品化產(chǎn)品Dynabeads。目前磁分離技術(shù)己經(jīng)在細(xì)胞分類(lèi)和分離、蛋白提純、核酸分離、細(xì)菌和病毒分離及免疫檢測(cè)等諸多方面展現(xiàn)出重要的應(yīng)用價(jià)值。

磁分離技術(shù)發(fā)展至今仍然面臨很多問(wèn)題。磁性微球自身缺陷及分離條件和環(huán)境都對(duì)生物大分子物質(zhì)的分離純化有著至關(guān)重要的影響。理想的磁性微球是磁分離技術(shù)的基礎(chǔ)，穩(wěn)定的分離環(huán)境是保證磁分離高效進(jìn)行的必要條件。理想的磁性微球需要具備足夠大的比表面積，表面配基的連接也要均勻，這樣才能夠保證對(duì)產(chǎn)物有高效的吸附率。因此，制備適應(yīng)不同要求的磁性微球已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。本文從磁性微球結(jié)構(gòu)特點(diǎn)出發(fā)，分析其基本原理，簡(jiǎn)單闡述磁性微球在細(xì)胞、蛋白質(zhì)及核酸等分離純化中的現(xiàn)狀，并對(duì)其在各部分的應(yīng)用趨勢(shì)進(jìn)行總結(jié)。

1 磁性微球的結(jié)構(gòu)性質(zhì)和分離原理

1.1 磁性微球的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

磁性微球是通過(guò)適當(dāng)?shù)睦砘椒▽o(wú)機(jī)磁性材料和有機(jī)高分子材料結(jié)合而形成的一種多功能復(fù)合材料。根據(jù)球芯和外殼材料的磁性特點(diǎn)可分為磁性核或磁性殼型，混合型和多層型。無(wú)機(jī)磁性材料主要有金屬 （Fe、Co、Ni）、鐵 氧 體 （MeO·Fe2O3、Fe3O4）、合金（FeCo）、鐵酸鹽等，其中Fe3O4由于磁性能好，制作工藝簡(jiǎn)單，成本低，而成為應(yīng)用最廣泛的磁核。高分子材料有天然與合成兩類(lèi)。天然高分子材料主要有瓊脂糖、淀粉、明膠、纖維素、殼聚糖等；合成高分子材料主要有聚苯乙烯、聚苯乙烯醇等。

目前磁性微球的制備方法主要有磁性粒子單體聚合法、磁性粒子聚合物組合法和磁性粒子聚合物原位生成法。磁性粒子聚合物組合法制備磁性微球方法簡(jiǎn)單，但制備出的磁性微球單分散性差，形貌不規(guī)則。磁性粒子單體聚合法主要是以高分子單體聚合的方法為主，相對(duì)磁性粒子聚合物組合法要復(fù)雜，制備出的磁性微球分布較寬、粒徑較大或包埋磁性粒子效果差，使得后期應(yīng)用受到限制［5］。通過(guò)不同的制備方法可得到性能不同的磁性微球，再加上表面功能基團(tuán)的修飾，使得磁性微球幾乎可以偶聯(lián)大部分生物活性物質(zhì)。應(yīng)用于生物磁分離技術(shù)中的磁性微球應(yīng)具有合適的磁響應(yīng)度、均一的粒徑分布、良好的生物相容性、穩(wěn)定的特異吸附表面等特性［6］。

1.2 磁性微球的分離原理

磁分離技術(shù)的分離有2種方式，即直接分離法和間接分離法。直接分離法是指磁性微球表面連接的是能夠特異性結(jié)合目標(biāo)產(chǎn)物的基團(tuán)，在溶液體系中特異性結(jié)合目標(biāo)產(chǎn)物，在磁場(chǎng)作用下與其他物質(zhì)分離。間接分離法是在分離前先對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行處理（例如抗原純化中，首先將抗原與第一抗體連接），使其能夠與磁性微球表面的基團(tuán)（第二抗體）結(jié)合，在磁場(chǎng)作用下將攜帶目標(biāo)產(chǎn)物的復(fù)合物分離出來(lái)，再借助其他手段解吸附目標(biāo)產(chǎn)物。

2 磁性微球在細(xì)胞分選中的應(yīng)用

磁性微球在細(xì)胞分離中的應(yīng)用主要分為2類(lèi)［7］，即非特異性吸附和特異性吸附。磁性微球具有較大的比表面積，并且有較強(qiáng)的極性。正常生理?xiàng)l件下細(xì)胞通常也是帶電的。磁性微球和細(xì)胞之間可以通過(guò)靜電引力結(jié)合。這類(lèi)吸附一般沒(méi)有選擇性，所以稱(chēng)之為非特異性吸附。而特異性吸附則是磁性微球表面偶聯(lián)某種細(xì)胞能夠特異性結(jié)合的物質(zhì)，通過(guò)特異性吸附分離細(xì)胞。這類(lèi)分離方法更加精確。所以，特異性吸附成為磁性微球在分離細(xì)胞中應(yīng)用的主要方法。

Molday R S等［8］首先提出用磁性微球來(lái)分離細(xì)胞，用熒光染料標(biāo)記含羧基的磁性微球，再用碳二亞胺活化，在其表面偶聯(lián)外源凝集素或抗體，成功地分離了B淋巴細(xì)胞和人血紅細(xì)胞。近年來(lái)，Haik Y等［9］采用特異性磁分離技術(shù)提取血紅細(xì)胞，結(jié)果顯示僅有0.85%的血紅細(xì)胞殘留，很大程度上提高了人血紅細(xì)胞的分離效率。Ting H C等［10］制備了連接抗生物素蛋白的聚苯乙烯-甲基丙烯酸縮水甘油酯微球，特異性吸附了骨髓干細(xì)胞表面抗原-1（Sca-1）細(xì)胞。Modak N等［11］則將磁分離技術(shù)和微流控技術(shù)相結(jié)合用于細(xì)胞分離，為研制磁性微球介導(dǎo)的微流體細(xì)胞分離系統(tǒng)提供了重要參數(shù)。還有研究者［12］通過(guò)磁分離技術(shù)特異性識(shí)別微藻類(lèi)細(xì)胞，從而快速?gòu)娜芤后w系中捕獲微藻類(lèi)植物。另外，磁性分離技術(shù)在原核細(xì)胞（如細(xì)菌細(xì)胞）分離中的應(yīng)用也有報(bào)道［13］。

目前，磁性微球在細(xì)胞分選中的應(yīng)用主要是以德國(guó)Meltenyi公司研發(fā)的免疫磁性細(xì)胞分選技術(shù)為標(biāo)準(zhǔn)［14］，其主要成分包括 MACS微珠、MACS分選柱和MACS分選器。MACS微珠是偶聯(lián)高度特異性單克隆抗體的超順磁性微球。首先把細(xì)胞用MACS微珠特異性標(biāo)記，然后使這些細(xì)胞通過(guò)一個(gè)放在強(qiáng)而穩(wěn)定磁場(chǎng)中的MACS分選柱，被磁性標(biāo)記的細(xì)胞滯留在柱里，而未被標(biāo)記的細(xì)胞則流出。當(dāng)分選柱移出磁場(chǎng)后，滯留柱內(nèi)的磁性標(biāo)記細(xì)胞就可以被洗脫出來(lái)，這樣就完全可以獲得標(biāo)記和未標(biāo)記的2個(gè)細(xì)胞組分，得到的細(xì)胞可立即用于后續(xù)試驗(yàn)。

Kuana W C等［15］利用帶有特定氨基的磁性單分散聚合微球成功的從人癌細(xì)胞系中分離到CD133陽(yáng)性細(xì)胞，其對(duì)癌癥的診斷具有重要意義。在癌癥治療過(guò)程中，化療前將骨髓抽出，采用細(xì)胞磁免疫分離方法，將腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞分離，將腫瘤細(xì)胞殺死后再將正常細(xì)胞注入患者體內(nèi)，在很大程度上減少了病人的痛苦，減少了放射性治療對(duì)病人身體的傷害。這在臨床上有相當(dāng)重要的實(shí)際意義。未來(lái)幾年這仍將是磁性微球在細(xì)胞分選中應(yīng)用的研究重點(diǎn)之一。

3 磁性微球在核酸分離中的應(yīng)用

磁性微球在核酸分離中的應(yīng)用能夠克服傳統(tǒng)核酸分離方法步驟繁瑣、收率低、接觸有毒試劑、實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化困難等缺陷，是未來(lái)核酸純化技術(shù)發(fā)展的一個(gè)重要方向。磁性微球在核酸分離中的應(yīng)用首先由Hawkins T L等［16］于1997年提出，隨后開(kāi)始快速發(fā)展。有研究者［17］將磁性明膠微球分離提取法和傳統(tǒng)氯仿提取法進(jìn)行了對(duì)比研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)磁性微球分離法獲得了大約2倍數(shù)量的DNA，并且DNA質(zhì)量也優(yōu)于傳統(tǒng)氯仿提取法。大腸埃希菌中核酸的分離也可以借助磁分離技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。Ma C等［18］制備了四氧化三鐵和二氧化硅的單分散復(fù)合微球，并將其成功用于大腸埃希菌中核酸的分離。2012年，Percin I等［19］通過(guò)乳液聚合法制備聚羥乙基甲基丙烯酸磁性復(fù)合納米微球，非特異性分離大腸埃希菌溶菌液中的質(zhì)粒DNA，結(jié)果表明該磁性納米微球使用6次后對(duì)質(zhì)粒DNA仍具有高選擇性，質(zhì)粒DNA的最終回收率可達(dá)92%。另外，王愛(ài)迪等［20］將磁性微球提取基因組核酸方法與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）相結(jié)合，成功建立了食品中轉(zhuǎn)基因成分的快速檢測(cè)新方法。

磁性微球在核酸分離中的應(yīng)用大大提高了核酸的分離效率，同時(shí)也為核酸分離的自動(dòng)化提供了技術(shù)支撐?；诖判苑蛛x的全自動(dòng)核酸分離系統(tǒng)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型技術(shù)。目前，已有不少公司致力于全自動(dòng)磁分離核酸分離系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)，并取得了較好的進(jìn)展。其中羅氏公司的最新產(chǎn)品Mag-NA Pure LC 2.0可從各種不同的樣品（如動(dòng)植物組織、血液、細(xì)胞、體液、食品等）中分離純化出高純度的（脫氧）核糖核酸。中國(guó)臺(tái)灣圓點(diǎn)納米技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司的Smart LabAssist全自動(dòng)磁珠核酸提取儀基于磁棒架上的磁棒吸附磁珠，將磁珠移至不同的試劑槽內(nèi)，可同時(shí)處理32個(gè)樣品?？迫A生物的核酸提取儀采用磁珠法，實(shí)現(xiàn)批量化，可同時(shí)處理93個(gè)樣品，自動(dòng)化操作，省時(shí)省力［21］。

目前，核酸的全自動(dòng)化提取仍然處在萌芽階段，這是核酸提取技術(shù)發(fā)展的必然趨勢(shì)，也是磁分離技術(shù)在核酸分離領(lǐng)域應(yīng)用研究的重點(diǎn)方向。在全自動(dòng)化核酸分離目標(biāo)實(shí)現(xiàn)的過(guò)程中需要不斷地去改進(jìn)究磁性微球自身的特性。

4 磁性微球在蛋白質(zhì)提純中的應(yīng)用

磁性微球在生物分離純化中的應(yīng)用大多都集中在細(xì)胞和核酸的分離上。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展，磁性微球在蛋白質(zhì)分離純化中的應(yīng)用也得到了快速發(fā)展。它是通過(guò)在微球表面修飾的功能基團(tuán)能與靶向蛋白可逆結(jié)合，從而達(dá)到靶蛋白分離的目的。與傳統(tǒng)分離方法相比有純度高、速度快、回收率高的優(yōu)點(diǎn)。

4.1 磁性微球在蛋白質(zhì)分離中的應(yīng)用

磁性微球在蛋白質(zhì)分離中的應(yīng)用主要集中于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室蛋白分離，如酶蛋白、抗體蛋白、重組蛋白等。Shao M F等［22］制備了由四氧化三鐵/二氧化硅/鎳鋁層狀氫氧化合物組成的三維核殼磁性微球，并將其用于重組蛋白純化中，結(jié)果表明微球上的Ni2＋對(duì)-His重組蛋白表現(xiàn)出較高的吸附率（239μg/mg）并能持續(xù)幾個(gè)純化周期。Li Z H等［23］利用染料配基（活性紅120）偶聯(lián)殼聚糖磁性微球從蛋清溶液中特異性吸附溶菌酶，循環(huán)使用4次后吸附率仍能達(dá)到92.6%，最終提取的溶菌酶純度達(dá)80.7%，回收率89.1%。Vijaykumar L D 等［24］將氨基苯硼酸磁性微球用于抗體分子的純化，通過(guò)磁性微球表面的氨基與抗體偶聯(lián)，每克磁球可結(jié)合170mg±10mg并能能洗脫回收160mg±5mg的人IgG；當(dāng)直接從CHO細(xì)胞上清中純化時(shí)，98%的IgG可結(jié)合，其中95%可有效回收，最終純度達(dá)到98%以上。

4.2 磁分離技術(shù)和其他技術(shù)結(jié)合在蛋白質(zhì)分離中的應(yīng)用

隨著磁分離技術(shù)的發(fā)展，許多研究者將磁分離技術(shù)與分子印跡或雙水相萃取相結(jié)合應(yīng)用于蛋白質(zhì)分離純化中。分子印跡聚合物包裹磁性粒子可形成表面具有分子印跡的磁性材料，通過(guò)印跡位點(diǎn)、形狀、官能團(tuán)的互補(bǔ)作用達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的［25］。該方法操作簡(jiǎn)單，選擇性高抗。Tan C J等［26］提出一種共價(jià)固定模板蛋白表面印跡法，利用乳液聚合法制備了表面共價(jià)結(jié)合模板蛋白（牛血清白蛋白）的印跡亞微米磁性粒子，該粒子內(nèi)包納米磁性粒子，有很強(qiáng)的超順磁性，在水溶液中對(duì)模板蛋白具有非常好的識(shí)別性能。由于模板蛋白固定對(duì)蛋白質(zhì)的成功印跡是十分重要的，因此該方法將有望成為一種普適性蛋白質(zhì)印跡法。另外，在雙水相體系中，親水性蛋白通常在表面活性劑較少的相中的分配系數(shù)較大，當(dāng)磁性吸附劑（磁性微球）引入雙水相后，吸附目標(biāo)蛋白，使其從表面活性劑較少的相進(jìn)入富含表面活性劑的相，可加速相分離，提高生產(chǎn)能力［27］。Becker J S等［28］將磁性吸附劑和雙水相體系結(jié)合，從溶菌酶和卵清蛋白混合體系中純化親水性蛋白溶菌酶，結(jié)果顯示溶菌酶最終回收產(chǎn)率達(dá)74%，純度超過(guò)80%。該方法可用于親水性蛋白的分離。

4.3 磁性微球分離蛋白質(zhì)的發(fā)展趨勢(shì)

磁性微球在蛋白質(zhì)分離純化領(lǐng)域的應(yīng)用主要依賴(lài)于吸附容量高、選擇性好、可重復(fù)使用、價(jià)格便宜的磁性微球的制備。因此，應(yīng)用于蛋白質(zhì)分離純化領(lǐng)域的理想磁性微球的制備將是未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)之一。另外，隨著智能高分子材料的快速發(fā)展［25］，將磁性微球與對(duì)外界環(huán)境（如溫度、pH、離子強(qiáng)度、光等）敏感的智能高分子材料相結(jié)合，合成智能型磁性微粒并將其用于蛋白質(zhì)的分離純化中也將是未來(lái)的發(fā)展方向之一。

5 展望

近年來(lái)，磁性微球分離技術(shù)用于生物分離純化簡(jiǎn)便而備受關(guān)注，隨著磁性微球的制備技術(shù)逐漸成熟，磁分離技術(shù)已經(jīng)由實(shí)驗(yàn)室走向?qū)嶋H應(yīng)用生產(chǎn)：①磁性微球分離法整體過(guò)程緩和，確?；钚猿煞纸Y(jié)構(gòu)完整保留；②分離純化步驟簡(jiǎn)單，所有反應(yīng)可在一個(gè)試管中完成；③無(wú)需昂貴的大型設(shè)備，比如離心機(jī)、色譜系統(tǒng)和超濾裝置等；④簡(jiǎn)便快速洗脫、產(chǎn)物濃度高；⑤磁分離技術(shù)很容易實(shí)現(xiàn)分離分析的自動(dòng)化。此外，目前國(guó)外已有相關(guān)產(chǎn)品，但是價(jià)格昂貴。國(guó)內(nèi)在此方面研究仍處于實(shí)驗(yàn)性階段，依然存在諸多問(wèn)題需改善：①磁性微球制備方法的深入研究，不同的方法從根本上影響著磁性微球在純化過(guò)程中性能的穩(wěn)定性；②磁性微球表面修飾的多樣化也決定著純化的效果和速度；③反復(fù)利用效果也是磁性微球現(xiàn)存的問(wèn)題之一。未來(lái)，磁性微球分離技術(shù)在生物分離純化中很有可能取代現(xiàn)有的純化技術(shù)，成為生物純化技術(shù)的主要趨勢(shì)。

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