人參皂苷Rb1對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的B16F10鼠黑素瘤細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

劉海平高 華付洪軍

人參皂苷Rb1對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的B16F10鼠黑素瘤細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

劉海平1高 華2付洪軍3

目的: 確定人參皂苷Rb1對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的B16F10黑素瘤細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。方法:將B16F10細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組，H2O2組和Rb1＋H2O2組(細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入10 mg/L、20 mg/L、50mg/L的人參皂苷Rb1和H2O2)。分別測(cè)定B16F10細(xì)胞活力、LDH漏出量、線粒體膜電位及細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果: H2O2作用24 h后，B16F10細(xì)胞活力降低至對(duì)照組的53.77%，而Annexin V和PI陽(yáng)性細(xì)胞比例為25.6%，顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。50 mg/L人參皂苷Rb1預(yù)處理后，B16F10細(xì)胞活力為對(duì)照組的77.75%，較H2O2組增加44.6%(P＜0.01)。Annexin V和PI陽(yáng)性細(xì)胞比例為14.4%，明顯低于H2O2組(P＜0.01)，并且LDH漏出率明顯降低，線粒體膜電位顯著升高。結(jié)論: 人參皂苷Rb1對(duì)H2O2所致的B16F10黑素瘤細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，有效提高其抗氧化應(yīng)激能力。

人參皂苷Rb1； B16F10細(xì)胞； 凋亡

白癜風(fēng)是一種獲得性、進(jìn)行性色素脫失性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但越來(lái)越多的證據(jù)表明，氧化應(yīng)激可能是白癜風(fēng)黑素細(xì)胞缺失的重要原因。過(guò)氧化氫(H2O2)是機(jī)體氧化代謝的產(chǎn)物，也是一類(lèi)活性氧自由基(ROS)。1Schallreuter等2研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)展期白癜風(fēng)患者表皮內(nèi)H2O2水平升高。體外研究也表明，H2O2能使黑素細(xì)胞樹(shù)突回縮，形態(tài)改變，抑制黑素細(xì)胞增殖和色素合成，故推測(cè)H2O2為主的氧化劑在黑素細(xì)胞環(huán)節(jié)對(duì)白癜風(fēng)的發(fā)病起重要作用。3人參皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1)內(nèi)含有能夠清除自由基的抗氧化物質(zhì)，不僅可以直接清除氧自由基，也可以通過(guò)增強(qiáng)胞漿內(nèi)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH－PX)及過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性間接清除氧自由基。4本實(shí)驗(yàn)以H2O2損傷B16F10鼠黑素瘤細(xì)胞造成氧化應(yīng)激損傷模型，觀察人參皂苷Rb1對(duì)黑素瘤細(xì)胞的保護(hù)作用，并從細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡等方面闡明其作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司，人參皂苷Rb1購(gòu)于南京廣潤(rùn)生物制品有限公司，四氮唑藍(lán)(MTT)和線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC－1)購(gòu)自Sigma公司，乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。Annexin V＆PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Calbiochem公司。B16F10鼠黑素瘤細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 常規(guī)培養(yǎng)的B16F10細(xì)胞隨機(jī)分組:①對(duì)照組，細(xì)胞培養(yǎng)液不加任何處理因素，37℃培養(yǎng)24 h；②H2O2組，細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為100μM的H2O2，37℃培養(yǎng)24 h；③Rb1＋H2O2組，將培養(yǎng)的B16F10細(xì)胞中分別加入10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L的人參皂苷Rb1預(yù)處理6 h后，細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度100μM的H2O2，37℃培養(yǎng)24 h。

1.3 檢測(cè)及方法

1.3.1 MTT法測(cè)定B16F10細(xì)胞活力 各組細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞密度為1×104cells/孔，每組8孔，每孔加MTT溶液10μL(5 g/L)，37℃孵育4 h；棄上清，每孔加入100μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物完全溶解。于波長(zhǎng)570 nm處測(cè)各孔吸光度(A)值，各組細(xì)胞活力以占對(duì)照組百分比表示。

1.3.2 LDH漏出量測(cè)定 收集各組細(xì)胞，離心、取上清，按說(shuō)明書(shū)以分光光度計(jì)比色法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清LDH漏出量。

1.3.3 JC－1線粒體功能檢測(cè) 收集各組細(xì)胞(2× 105cells/組)，用預(yù)溫(37℃)的完全培養(yǎng)基調(diào)整至1 mL。細(xì)胞懸液加入JC－1儲(chǔ)存液(1 mg/mL)2.5μL，振蕩細(xì)胞懸液直至標(biāo)本形成均一的紅紫色；37℃避光保存10 min。加入2 m L PBS至細(xì)胞懸液中，2000 r/ min室溫離心5 min，去上清；以0.3 mL PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析。用發(fā)紅色熒光細(xì)胞百分率(JC－1＋%)表示線粒體膜電位正常細(xì)胞的比例。

1.3.4 Annexin V＆PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞(3×105cells/組)，用PBS洗滌2次(2000 r/min離心5 min)，棄上清；加入500μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞；細(xì)胞懸液中加入5μL Annexin V－FITC混勻后，然后加入5μL PI混勻；室溫、避光、反應(yīng)5～15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)圖采用SigmaPlot8.0軟件制作。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rb1對(duì)H2O2所致B16F10細(xì)胞活力的影響 見(jiàn)圖1。MTT結(jié)果顯示:H2O2組B16F10鼠黑素瘤細(xì)胞活力為對(duì)照組細(xì)胞活力的(53.77±5.54)%，顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)；10 mg/L Rb1＋H2O2組和20 mg/L Rb1＋H2O2組細(xì)胞活力分別為對(duì)照組細(xì)胞活力的(56.74±2.96)%、(61.61±3.48)%，與H2O2組比較無(wú)顯著差異(P＝0.255和P＝0.097)；50mg/L Rb1＋H2O2組細(xì)胞活力為對(duì)照組細(xì)胞活力的(77.75± 4.41)%，較H2O2組增加44.6%(P＜0.01)。

圖1 人參皂苷Rb1對(duì)B16F10細(xì)胞活力的影響

2.2 人參皂苷Rb1對(duì)H2O2所致B16F10細(xì)胞LDH漏出量的影響 見(jiàn)表1。與對(duì)照組相比，H2O2組LDH漏出量明顯增加(P＜0.01)；與H2O2組相比，50 mg/LRb1＋H2O2組LDH漏出量顯著降低(P＜0.01)；而10mg/L Rb1＋H2O2組和20 mg/L Rb1＋H2O2組LDH漏出量無(wú)明顯降低(P＝0.173和P＝0.085)。

2.3 人參皂苷Rb1對(duì)H2O2所致B16F10細(xì)胞線粒體膜電位的影響 見(jiàn)表1。H2O2處理后，B16F10細(xì)胞線粒體膜電位較對(duì)照組顯著降低(P＜0.01)；10 mg/L和20 mg/L Rb1預(yù)處理后，線粒體膜電位與H2O2組無(wú)顯著差異(P＝0.227和P＝0.075)；而50 mg/L Rb1預(yù)處理后線粒體膜電位明顯升高(P＜0.01)。結(jié)果提示，50 mg/L人參皂苷Rb1具有保護(hù)線粒體，減輕H2O2對(duì)細(xì)胞線粒體的損傷。

表1 B16F10細(xì)胞LDH漏出量和線粒體膜電位(MMP)的變化

2.4 人參皂苷Rb1對(duì)H2O2致B16F10細(xì)胞凋亡的影響 見(jiàn)圖2。流式結(jié)果顯示，對(duì)照組Annexin V陽(yáng)性細(xì)胞比例(4.2±1.2)%，Annexin V和PI雙陽(yáng)性細(xì)胞比例(8.1±1.8)%。給予H2O2處理后，凋亡水平明顯增加(P＜0.01)，Annexin V陽(yáng)性細(xì)胞比例(17.3±2.5)%，Annexin V和PI雙陽(yáng)性細(xì)胞比例(25.6±3.7)%。給予人參皂苷Rb1(50mg/L)預(yù)處理后，Annexin V陽(yáng)性細(xì)胞比例(9.5±2.6)%，Annexin V和PI雙陽(yáng)性細(xì)胞比例(14.4±4.0)%，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示明顯降低了凋亡水平(P＜0.01)。而10 mg/L和20 mg/L人參皂苷Rb1作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.437和P＝0.195)。

圖2 人參皂苷Rb1對(duì)H2O2致B16F10細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

H2O2是一種活性氧自由基(ROS)，能自由穿過(guò)細(xì)胞膜、核膜與金屬離子反應(yīng)，產(chǎn)生羥自由基，羥自由基可以與嘌呤和嘧啶發(fā)生反應(yīng)，損傷細(xì)胞DNA。5，6ROS還能作為細(xì)胞內(nèi)信使激活轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)影響基因轉(zhuǎn)錄，促使凋亡基因上調(diào)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。7目前研究表明，低濃度(小于100μM)H2O2主要導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，高濃度H2O2主要導(dǎo)致細(xì)胞壞死。8本研究結(jié)果表明，B16F10黑素瘤細(xì)胞在H2O2作用下細(xì)胞活力和線粒體膜電位均下降，培養(yǎng)上清中LDH漏出量及細(xì)胞凋亡率增加，說(shuō)明H2O2可通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激引起黑素瘤細(xì)胞的凋亡。

由于氧化應(yīng)激在白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制中的重要作用，抗氧化劑在白癜風(fēng)治療中的作用逐漸引起重視。9Jeong等10研究發(fā)現(xiàn)槲皮素和綠茶提取物具有較強(qiáng)的抗氧化作用，可以抵抗氧化應(yīng)急對(duì)細(xì)胞的損傷，對(duì)H2O2誘導(dǎo)的Mel－Ab細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。Rojas等11研究發(fā)現(xiàn)，外用抗氧化劑及線粒體刺激劑聯(lián)合口服抗氧化劑及苯丙氨酸治療穩(wěn)定型白癜風(fēng)療效最好。作者分析該療法可能是通過(guò)糾正ROS造成的細(xì)胞和線粒體損傷使黑素細(xì)胞功能得到恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)使用的人參皂苷Rb1是近年來(lái)研究較多的一類(lèi)人參單體，具有抗氧化、抗衰老、提高免疫力和增強(qiáng)記憶力等功效。4，12

50 mg/L人參皂苷Rb1預(yù)處理后H2O2所致B16F10黑素瘤細(xì)胞活力降低明顯受到抑制，減少了細(xì)胞凋亡的發(fā)生，這說(shuō)明人參皂苷Rb1對(duì)氧化應(yīng)激損傷致B16F10細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，50 mg/L人參皂苷Rb1能夠有效地減少細(xì)胞內(nèi)LDH漏出量，部分恢復(fù)細(xì)胞線粒體膜電位水平。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，線粒體除了具有細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換的功能，還是參與細(xì)胞凋亡的重要細(xì)胞器，線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。本研究結(jié)果提示，人參皂苷Rb1抗細(xì)胞凋亡的作用與減少細(xì)胞內(nèi)ROS過(guò)氧化損傷和保護(hù)線粒體功能有關(guān)。

人參具有保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免受應(yīng)激損傷的作用。本研究觀察用人參的有效成分人參皂苷Rb1可以有效提高黑素瘤細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的作用，為臨床應(yīng)用人參提取物治療白癜風(fēng)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(收稿:2013－09－03 修回:2013－12－07)

Protective effects of ginsenoside Rb1 on B16F10 cells apoptosis induced by H2O2

LIU Hai-ping，GAO Hua，F(xiàn)U Hong-jun.Department of Dermatology，Beijing Tieying Hospital，Beijing，100078

Objective:To determine the protective effects of ginsenoside Rb1 on B16F10 cells apoptosis induced by H2O2.Methods:B16F10 cellswere random ly divided into blank control group，H2O2group and Rb1＋H2O2group.In the Rb1＋H2O2group B16F10 cells were cultured with ginsenoside Rb1(in three doses of 10mg/L，20mg/L and 50mg/L)before treated with H2O2.The viability of B16F10 cellswas calculated by MTT assay.The outleakage of lactate dehydrogenase(LDH)，mitochondrialmembrane potential and the level of apoptosisweremeasured accordingly.Results:After treated with H2O2for 24h，the viability of B16F10 cells decreased to 53.77%of the control group，while the proportion of Annexin V＆PIpositive cells significantly increased to 25.6%of the control group(P＜0.01).When pre－treated with 50mg/LRb1，the cell viability increased to 77.75%of the control group，which was 44.6%higher than that of the H2O2group(P＜0.01).The proportion of Annexin V＆PI positive cells significantly decreased to 14.4%compared with H2O2group(P＜0.01).Meanwhile ginsenoside Rb1(50mg/L)significantly decreased LDH outleakage and inhibited the decrease ofmitochondrialmembrane potential.Conclusion:Ginsenoside Rb1 can protect the B16F10 cells against H2O2－induced apoptosis and effectively improve the ability of antioxidative stress.

ginsenoside Rb1；B16F10 cells；apoptosis

1北京豐臺(tái)區(qū)鐵營(yíng)醫(yī)院皮膚科，北京，100078

2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京，100050

3山東濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院，濟(jì)寧，272011