胃蛋白酶中性蛋白酶水解酪蛋白的研究

王立暉，盧楠，李培駿

（1.現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300350；2.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北石家莊050026；3.溫州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)院，浙江溫州325000）

胃蛋白酶中性蛋白酶水解酪蛋白的研究

王立暉1，盧楠2，李培駿3

（1.現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300350；2.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北石家莊050026；3.溫州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)院，浙江溫州325000）

本實(shí)驗(yàn)主要研究雙蛋白酶（胃蛋白酶-中性蛋白酶）催化酪蛋白水解的反應(yīng)過(guò)程。實(shí)驗(yàn)中首先設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)確定了中性蛋白酶和胃蛋白酶各自單獨(dú)水解酪蛋白的最佳反應(yīng)條件，分別為酶濃度0.6%、溫度55℃、pH 8.0、底物濃度2%和酶濃度1.5%、溫度55℃、pH 1.6、底物濃度10%。在此基礎(chǔ)上以雙蛋白酶作為催化劑水解酪蛋白的反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行研究，并利用層析分離技術(shù)和液相色譜初步驗(yàn)證了水解產(chǎn)物中含有β-啡肽-7等多肽類物質(zhì)。

酪蛋白；水解度；胃蛋白酶；中性蛋白酶；生物活性多肽

酪蛋白是乳制品中含量最高的蛋白質(zhì)，是一種完全蛋白質(zhì)，內(nèi)含人體自身無(wú)法合成的全部的8種必需氨基酸，可以為生物體生長(zhǎng)發(fā)育提供堅(jiān)實(shí)的營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)[1]。在適當(dāng)?shù)鞍酌傅拇呋拢业鞍啄軌虬l(fā)生水解反應(yīng)，生成眾多具有獨(dú)特生物活性和重要生理功能的多肽類物質(zhì)，例如，酪蛋白磷酸肽具有防止礦物質(zhì)流失、預(yù)防齲齒，防治骨質(zhì)疏松與佝僂病，促進(jìn)動(dòng)物體外受精，調(diào)節(jié)血壓，治療缺鐵性貧血等多種生理功效。因此，酪蛋白已被確認(rèn)是未來(lái)用于開發(fā)新藥物和新型功能性食品的重要原料物之一。

本實(shí)驗(yàn)分別研究了單蛋白酶與雙蛋白酶催化酪蛋白水解的過(guò)程。首先采用正交試驗(yàn)法，分別確定了中性蛋白酶和胃蛋白酶單獨(dú)水解酪蛋白的最佳反應(yīng)條件，并在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了雙蛋白酶（中性蛋白酶與胃蛋白酶）水解酪蛋白的過(guò)程，并利用層析分離技術(shù)和高效液相色譜儀初步驗(yàn)證了水解產(chǎn)物中的多肽類物質(zhì)的種類及含量。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

干酪素（食品級(jí)）：徐州百順生物科技有限公司；胃蛋白酶（EC 3.4.23.1）：Sigma-Aldrich公司；中性蛋白酶：Novo公司；甲醛（分析純）：梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；交聯(lián)葡聚糖Sephadex G-15：Sigma-Aldrich公司；甲醇（色譜級(jí)）：天津江天化工技術(shù)有限公司；乙腈（色譜級(jí)）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；β-酪啡肽-7（純度98%）：梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；其余試劑純度等級(jí)均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

PHS-3C型pH計(jì)：上海偉業(yè)儀器廠；85-2B數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所；BILONHW-10S水浴恒溫振蕩器：上海比朗儀器制造有限公司；DHG-06型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：深圳市耐美特工業(yè)設(shè)備有限公司；FA3204B電子分析天平：上海精科天美貿(mào)易有限公司；HD-3紫外檢測(cè)儀：美國(guó)熱電有限公司；BT101S恒流泵：武漢恒流泵業(yè)制造有限公司；Centrifuge 5810R離心機(jī)：Sigma-Aldrich公司；Lyostar凍干機(jī)：新默真科技（北京）有限公司；Heto Hsc 500記錄儀：丹麥Heto公司；QT超聲波儀：天津市瑞普電子儀器公司；LC-2900型高效液相色譜儀：Sigma-Aldrich公司；LC-10AT液相流動(dòng)泵：Sigma-Aldrich公司；SPD-10A型紫外-可見監(jiān)測(cè)器：Sigma-Aldrich公司；2010色譜工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：Sigma-Aldrich公司；7 52型（自動(dòng)）紫外分光光度計(jì)：上海天普分析儀器有限公司；微孔過(guò)濾膜（0.45 nmφ50）：天津大學(xué)科威公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 單酶催化水解酪蛋白

1）酪蛋白溶液（蛋白含量為0.785）配制

向85℃的NaOH（0.1mol/L，100mL）溶液中緩慢加入干酪素（酪蛋白），攪拌溶解，蒸餾水定容至250mL。調(diào)節(jié)溫度和pH至蛋白酶的最適催化條件（來(lái)源于文獻(xiàn)資料），恒溫儲(chǔ)藏待用。

2）水解反應(yīng)

中取100mL酪蛋白溶液置于恒溫振蕩水浴鍋中的錐形瓶，分別加入等量的蛋白酶（中性蛋白酶或胃蛋白酶）后開始水解反應(yīng)，一段時(shí)間后，取出錐形瓶并立即倒入強(qiáng)堿液終止反應(yīng)。

3）水解度的測(cè)定

水解度（Degree of Hydorlysis，DH）是指原料蛋白中肽鍵裂解的百分?jǐn)?shù)，也表示蛋白質(zhì)被水解的程度。由于蛋白質(zhì)每斷裂一個(gè)肽鍵就會(huì)生成一個(gè)-NH2和-COOH，因此只需要定量測(cè)定增加的-NH2和-COOH并通過(guò)計(jì)算即可求得該蛋白在反應(yīng)中的水解度。

本實(shí)驗(yàn)中采用甲醛法進(jìn)行酪蛋白水解度的測(cè)定，具體操作為：將終止反應(yīng)后的反應(yīng)液（10mL）與去二氧化碳蒸餾水（30mL）想混合，調(diào)節(jié)混合液pH到8.2后加入甲醛（10mL，pH 7.0）。1min后，用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定至pH 9.2，記錄所用NaOH體積。以酪蛋白溶液為底物反應(yīng)做空白試驗(yàn)。水解度的計(jì)算公式如下：

式中：M為NaOH溶液的濃度，（mol/L）；V為水解液滴定時(shí)消耗的氫氧化鈉溶液的體積，mL；V0為空白液滴定時(shí)消耗的氫氧化鈉溶液的體積，mL；Cwo，V1為所取酪蛋白溶液的濃度，（mg/mL）和體積，mL；X為酪蛋白樣品中蛋白質(zhì)的含量；8.2為每克酪蛋白中所含的肽鍵數(shù)，（mmol/g）。

4）正交試驗(yàn)

選擇實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng)溫度，酪蛋白溶液pH，酪蛋白濃度，蛋白酶濃度等適當(dāng)?shù)囊蛩厮?，?gòu)建不同蛋白酶做催化劑的四因素三水平的L9（34）正交實(shí)驗(yàn)表。每組變量實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。研究不同反應(yīng)條件對(duì)酪蛋白水解度的影響，并分析后確定各蛋白酶的最佳反應(yīng)條件。

1.3.2 雙蛋白酶催化水解酪蛋白

1）以中性蛋白酶水解酪蛋白的最佳反應(yīng)條件為實(shí)驗(yàn)條件，在反應(yīng)一段時(shí)間（60、90、120min）后，終止反應(yīng)，取一定量的反應(yīng)液檢測(cè)酪蛋白的水解度。

2）以上一步得到的反應(yīng)液為底物溶液，胃蛋白酶為催化劑，在該酶最佳催化條件下（酶濃度1.5%、溫度55℃、PH 1.6）分別反應(yīng)0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，取出反應(yīng)液并終止反應(yīng)，測(cè)定此時(shí)酪蛋白的水解度。

1.3.3 酪蛋白水解產(chǎn)物的定性研究

1）以交聯(lián)葡聚糖作為層析柱填充物，用水溶脹后填入φ17 cm的層析柱中，確保壓實(shí)后柱中填充物高度為57.5 cm。用3倍柱床體積的緩沖液洗脫柱子。

2）將水解樣品經(jīng)過(guò)離心、過(guò)濾、濃縮等初步提純后，將反應(yīng)液用制得的層析柱分離，收集目標(biāo)流出物，冷凍干燥得到水解產(chǎn)物。

1.3.4 RP-HPLC檢測(cè)酪蛋白水解產(chǎn)物

1）通過(guò)查詢資料可知，酪蛋白水解后得到產(chǎn)物為多肽鏈（5個(gè)~10個(gè)氨基酸組成的具有生物活性的多肽類物質(zhì)），平均長(zhǎng)度可用公式[4]計(jì)算得出。

2）本實(shí)驗(yàn)中以其中一種典型的七肽，即腦啡肽中的β-酪啡肽-7作為主要研究對(duì)象進(jìn)行分析檢測(cè)。張?jiān)词鏪5]的研究介紹了利用反相高效液相色譜儀（RPHPLC）對(duì)β-酪啡肽-7進(jìn)行檢測(cè)的操作條件，通過(guò)這個(gè)方法能夠?qū)崿F(xiàn)驗(yàn)證組合酶水解酪蛋白得到的反應(yīng)液中是否含有β-酪啡肽-7等生物活性多肽類物質(zhì)。

3）準(zhǔn)確稱取2.65mgβ-酪啡肽-7標(biāo)準(zhǔn)樣，用甲醇溶解并定容至5mL，溶解時(shí)可用超聲波儀助溶。取標(biāo)準(zhǔn)品溶液（10μL）用液相色譜儀進(jìn)行定性檢測(cè)，色譜檢測(cè)條件為色譜柱：SHIM-PACK VP-ODSC18；檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm，柱溫40℃，柱壓9.6MP；乙腈∶水=20∶80作為流動(dòng)相，流速為1mL/min。重復(fù)多次檢測(cè)，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。檢測(cè)過(guò)程中溶劑在使用前需要用微孔濾膜過(guò)濾以及超聲波儀脫氣處理。

4）準(zhǔn)確稱取一定數(shù)量反應(yīng)液提純物，用甲醇溶解并定容至5mL，超聲波儀助溶，在上述條件下用液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)樣品液，觀察出峰情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 單蛋白酶催化水解酪蛋白

2.1.1 中性蛋白酶催化水解酪蛋白反應(yīng)分析

在不同反應(yīng)條件下，以中性蛋白酶作為催化劑催化酪蛋白水解0.5 h，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建L9（34）正交試驗(yàn)（表1），不同反應(yīng)條件下的水解度結(jié)果如表2所示。對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析（表3）可知，4個(gè)變量因素（反應(yīng)溫度，酪蛋白溶液pH，酪蛋白濃度，反應(yīng)液中酶濃度）中顯著性的顯著程度為：酪蛋白溶液pH（D）＜反應(yīng)溫度（C）＜酪蛋白濃度（A）＜反應(yīng)液中酶濃度（B），從而確定四因素水平的最佳組合方式為：A2B3C2D3，即中性蛋白酶催化水解酪蛋白的最佳反應(yīng)條件為：0.6%酶濃度、2%酪蛋白濃度、55℃反應(yīng)溫度、酪蛋白溶液pH 8.0。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素表Table1 Levelsof factorsof orthogonal test L9（34）

表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table2 Resultsof orthogonal test L9（34）

表3 L9（34）正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析表Table3 Datasheet AMalysisof of orthogonal test L9（34）

2.1.2 胃蛋白酶催化水解酪蛋白反應(yīng)分析

在不同反應(yīng)條件下，以中性蛋白酶作為催化劑催化酪蛋白水解2 h，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建L9（34）正交實(shí)驗(yàn)（表4），不同反應(yīng)條件下的水解度結(jié)果如表5所示。

表4 L9（34）正交試驗(yàn)因素表Table4 Levelsof factorsof orthogonal test L9（34）

表5 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table5 Resultsoforthogonal test L9（34）

通過(guò)方差分析，確定正交試驗(yàn)中4個(gè)因素的顯著性順序?yàn)椋悍磻?yīng)溫度（D）＜酪蛋白溶液pH（C）＜反應(yīng)液中酶濃度（B）＜酪蛋白濃度（A），最佳因素組合為A1B3C3D3，估計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)值為y=8.53+2.36+1.46+0.5+ 0.24=13.10。以實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析結(jié)果為基礎(chǔ)，結(jié)合需要的最佳水解度值和成本因素，最終確定胃蛋白酶催化酪蛋白水解的最佳反應(yīng)條件為：酪蛋白濃度10mg/mL，反應(yīng)液中酶濃度1.5%；反應(yīng)液pH 1.6，反應(yīng)溫度55℃。

2.2 雙蛋白酶催化水解酪蛋白的反應(yīng)分析

以雙蛋白酶（中性蛋白酶-胃蛋白酶）作為催化劑，不同反應(yīng)時(shí)間條件下，水解酪蛋白結(jié)果如表6所示。

表6 雙酶催化水解酪蛋白的結(jié)果Table6 Hyd rolysis resultsof casein catalyzed by doubleenzyme

從表6中結(jié)果可知，相比單一蛋白酶作為催化劑水解酪蛋白，雙酶體系可以取得更佳的水解效果。隨著中性蛋白酶催化時(shí)間的增加，最終得到的酪蛋白水解度也隨之增加，并且水解度明顯優(yōu)于單酶的水解結(jié)果。

綜上所述，雙蛋白酶水解酪蛋白的最佳反應(yīng)條件為：中性蛋白酶水解30min后，胃蛋白酶水解2.5 h。并以此條件作為下一階段實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)條件，從而對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行研究。

2.3 酪蛋白水解產(chǎn)物的定性研究

2.3.1 水解產(chǎn)物的層析分離結(jié)果

雙酶催化酪蛋白水解反應(yīng)中的B13水解液經(jīng)分離和提純。將不同時(shí)間的流出液進(jìn)行吸光度檢測(cè)，通過(guò)對(duì)比酪蛋白空白曲線圖和B13水解液的吸光度-洗脫峰的曲線（圖1和圖2）可以清晰證明，水解反應(yīng)后有新的物質(zhì)產(chǎn)生。

2.3.2 水解產(chǎn)物組分的標(biāo)準(zhǔn)品的色譜分析

2.3.2.1 β-啡肽-7標(biāo)準(zhǔn)物的色譜分析

利用反相高效液相色譜儀對(duì)β-啡肽-7標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行色譜分析，結(jié)果如圖3所示。

圖1 酪蛋白空白Fig.1 Casein

圖2 雙酶水解液Fig.2 Subtilisin-pepsin hydrolyte

圖3 β-啡肽-7標(biāo)準(zhǔn)品色譜分析圖Fig.3 ChroMatograManalysis figureofβ-啡肽-7

從圖中可以看出β-啡肽-7特征峰的保留時(shí)間是29.912min，峰面積為7 584 300.5，峰高度是327.534，含量為0.977 8%。

2.3.2.2 樣品B13的液相色譜檢測(cè)

利用反相高效液相色譜儀對(duì)水解度為15.91%的B13樣品的提純物進(jìn)行檢測(cè)分析，并將結(jié)果與β-啡肽-7標(biāo)準(zhǔn)樣的特征峰進(jìn)行比對(duì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)記錄如圖4和表7。

圖4 中性蛋白酶-胃蛋白酶組合中目標(biāo)峰的檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Subtilisin-pepsin coMbination HPLC detection results

表7 RP-HPLC檢測(cè)結(jié)果Table7 Resultsof RP-HPLC

檢測(cè)結(jié)果證實(shí)由雙蛋白酶催化酪蛋白反應(yīng)得到的水解物中含有β-酪啡肽-7等生物活性多肽。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)主要研究雙蛋白酶（中性蛋白酶-胃蛋白酶）催化酪蛋白水解的反應(yīng)過(guò)程。實(shí)驗(yàn)中首先設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)確定了中性蛋白酶和胃蛋白酶各自單獨(dú)水解酪蛋白的最佳反應(yīng)條件，分別為酶濃度0.6%、底物濃度2%、溫度55℃、pH 8.0和酶濃度0.15%、溫度55℃、pH 7.5、底物濃度6%。在此基礎(chǔ)上以雙蛋白酶作為催化劑水解酪蛋白的反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行研究，并利用層析分離技術(shù)和液相色譜初步驗(yàn)證了水解產(chǎn)物中含有β-啡肽-7（保留時(shí)間30.410min、峰面積731 924、峰面積百分比（%）0.626）。

酶解酪蛋白是蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域中的熱門方向，各種酪蛋白的酶解方法、水解產(chǎn)物的提純和檢測(cè)手段也越來(lái)越受國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視，尤其是對(duì)水解產(chǎn)物中所含的生物活性肽的研究，不僅擴(kuò)展了食物蛋白的應(yīng)用范圍，也為動(dòng)物學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)、生物醫(yī)藥以及食品科學(xué)等學(xué)科的發(fā)展提供了一個(gè)新的思路。我們能夠相信，在功能食品和飼料添加劑制造領(lǐng)域中，生物活性多肽的發(fā)展前景是非常廣闊的。

[1]鄒思湘.酪蛋白源活性肽[J].生命的科學(xué),1993,13(1)：18

[2]林立.酶促水解反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)和優(yōu)化[D].華東理工大學(xué)碩士學(xué)位論文,2001：18-19

[3]Brantl V,Teschemacher H,Henschen A.Novel opioid peptides derived froMcasein(β-casomorphins)[J].I.Isolation froMbovine casein peptone.Hoppe～Seyler's ZPhysiolChem,1979,360：1211-6

[4]J.Adler Nissen.Enzymatic hydrolysisof food proteins[M].New York, Elsevier Appl.Sci.Pub：1986

[5]張?jiān)词?鄒思湘.反相高效液相色譜法分析結(jié)構(gòu)相似酪啡肽[J].食品科學(xué)2005,26(2)：172-174

Reseach on the Hydrolytic Course froMCasein w ith Pepsin and Subtilisin

WANGLi-hui1，LUNan2，LIPei-Jun3
（1.Tianjin Modern Vocation Technology College，Tianjin 300350，China；2.HebeiChemicaland Pharmaceutical Vocational Technology College，Shijiazhuang050026，Hebei，China；3.Wenzhou Instiute of Technology and Calibration，Wenzhou 325000，Zhejiang，China）

The focus of the experiment is reseach on the hydrolytic course froMcasein with double enzymes（pepsin and subtilisin）.Firstly,thebest testconditionsof casein hydrolysate catalyzed were obtained by dispase or pepsin according to the results of orthogonal tests which were designed firstl.the optimistic conditions for dispase or pepsinwere as follow：enzyme concentration 0.6%，temprature 55℃，pH 8.0，substrate concentration 2%and enzyme concentration 1.5%，temprature 55℃，pH 1.6，substrate concentration 10%.Subsequently，reseachon thehydrolytic coursecatalyzed bysubtilisin-pepsinwascarried and thehydrolysateconteinsβ-CM-7 biologicalactivitypeptidesidentified by chromatographyand RP-HPLC.

casein；degree ofhydrolysis；pepsin；dispase；biologicalactivity peptides

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.18.099

2014-09-24

王立暉（1981—），男（漢），副教授，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。