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    基于分子印跡膜用于檢測(cè)組胺的電化學(xué)傳感器

    2014-03-21 07:42:50姜隨意寧保安白家磊彭媛張娜高志賢
    食品研究與開發(fā) 2014年18期
    關(guān)鍵詞:組胺印跡電化學(xué)

    姜隨意,寧保安,白家磊,彭媛,張娜,高志賢

    (軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所,天津市環(huán)境與食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300050)

    基于分子印跡膜用于檢測(cè)組胺的電化學(xué)傳感器

    姜隨意,寧保安,白家磊,彭媛,張娜,高志賢*

    (軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所,天津市環(huán)境與食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300050)

    利用電化學(xué)傳感技術(shù),對(duì)水樣中的組胺進(jìn)行檢測(cè),為研發(fā)相應(yīng)的食品快檢技術(shù)與設(shè)備提供技術(shù)基礎(chǔ)。在金電極上制備分子印跡膜,應(yīng)用電化學(xué)進(jìn)行表征,建立電化學(xué)檢測(cè)組胺的方法。該方法檢出限:0.5 ng/mL,檢測(cè)范圍:0.5 ng/mL~50 ng/mL,檢測(cè)時(shí)間<30min。所建立的方法對(duì)于檢測(cè)水樣的組胺具有靈敏度高、準(zhǔn)確度好和精密度高。

    電化學(xué)傳感技術(shù);組胺;分子印跡膜;食品快檢技術(shù)

    組胺(Histamine,HA),又名組織胺,分子式:C5H9N3,化學(xué)名4(5)-(2-氨乙基)咪唑。組氨是一種生物胺,它是由組胺酸分解而成,而組氨酸是蛋白質(zhì)經(jīng)過分解后產(chǎn)生的一種氨基酸,組胺分子量小,只有111 Da[1],組胺分子式及結(jié)構(gòu)類似物見圖1,食品中組胺主要是組氨酸在莫根氏變形桿菌、組胺無色桿菌等微生物和組氨酸脫羧酶等共同作用下發(fā)生脫羧反應(yīng)產(chǎn)生的。人體中組胺主要存儲(chǔ)于肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞中[2-3],當(dāng)機(jī)體受到過敏原刺激時(shí),會(huì)大量的產(chǎn)生組胺,局部濃度的增加導(dǎo)致過敏反應(yīng)[4],眾所周知,組胺不僅作為速發(fā)型超敏反應(yīng)的一種細(xì)胞間化學(xué)介質(zhì)[5],而且也是大腦中的神經(jīng)遞質(zhì),大腦中濃度達(dá)到1μmol/kg~6μmol/kg[6]。組胺有毒性,可以降低血壓,當(dāng)有機(jī)體攝入組胺超過100mg(或每千克體重1.5mg)時(shí),即可引起食物中毒[7]。在由生物胺導(dǎo)致的食品安全問題中,組胺對(duì)人類的健康的影響最大。全國(guó)曾多次發(fā)生過組胺食物中毒事件。世界上很多國(guó)家對(duì)食品中組胺含量做了限量要求:美國(guó)FDA要求水產(chǎn)品中組胺含量不得超過50mg/kg[8];歐盟規(guī)定鯖科魚類中組胺含量不得超過100mg/kg,其它食品中的組胺含量不得超過100mg/kg~800mg/kg;我國(guó)規(guī)定鮐魚中組胺含量不得超過100mg/100 g,其它魚類不得超過30mg/100 g。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,組胺是一種自然產(chǎn)生的物質(zhì),在許多蔬菜、水果、啤酒、魚、奶酪和紅葡萄酒中都能產(chǎn)生組胺[7],為了給食品加工生產(chǎn)時(shí)的危害分析臨界控制點(diǎn)(HACCP)認(rèn)證提供科學(xué)依據(jù),在食品和食品加工行業(yè),快速、準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)組胺顯得十分必要。組胺的檢測(cè)方法主要有:有偶氮試劑比色法、熒光分光光度法、高效液相色譜法(HPLC法)[9]、氣相色譜法(GC)[10]、薄層色譜法(TLC)、酶聯(lián)免疫方法(ELISA法)[11]、毛細(xì)管電泳法(CE)和生物學(xué)法等。這些方法所用試劑、器皿較多,操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、靈敏度低。另外,我國(guó)現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法是GB/T5009.45-2003和國(guó)標(biāo)《水質(zhì)組胺等五種生物胺的測(cè)定高效液相色譜法》(GB/T21970-2008),目前還沒有應(yīng)用電化學(xué)法檢測(cè)食品中組胺的標(biāo)準(zhǔn),在國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)檢索中,應(yīng)用電化學(xué)法檢測(cè)食品中組胺的方法也很少,電化學(xué)法有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、快速等優(yōu)點(diǎn),因此建立食品中組胺的電化學(xué)法檢測(cè)方法十分必要,本項(xiàng)目采用電化學(xué)法開展了這一方法標(biāo)準(zhǔn)化的研究和起草工作。

    圖1 組胺及其結(jié)構(gòu)類似物Fig.1 Structuresof histaMineand structuralanalogs

    在本項(xiàng)目中,我們建立了基于分子印跡膜檢測(cè)組胺的電化學(xué)傳感器,相對(duì)于傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù),該技術(shù)提出了一個(gè)新的發(fā)展空間。含有大量印跡孔穴的分子印跡聚合物(MIPs)是人工合成受體,它具有類似天然抗體或酶的特異性和選擇性[12],這種含有合成識(shí)別元件的仿生傳感器可以在各種惡劣的環(huán)境中使用。MIPs包含大量的印跡孔穴,這些孔穴能夠通過形狀、大小和官能團(tuán)(如氫鍵)與靶分子進(jìn)行互補(bǔ),它特別適用于小分子的檢測(cè)[13]。在目標(biāo)分子存在的情況下,電阻抗會(huì)發(fā)生變化,這些變化可以通過電化學(xué)傳感器表征。該方法有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):首先,MIPs合成成本低[14];第二,MIPs具有較好的穩(wěn)定性,能承受極端的溫度和pH環(huán)境[15];第三,MIPs是通過非共價(jià)鍵的方法制備,具有良好的再生性[16]。至今,基于MIPs檢測(cè)組胺的文獻(xiàn)很少,本研究還研究了pH對(duì)檢測(cè)組胺的影響。該傳感器加入0.1MHCl溶液再生后可重復(fù)使用。我們成功地實(shí)現(xiàn)了對(duì)組胺的檢測(cè),檢測(cè)限為0.5 ng/mL。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑

    組胺標(biāo)準(zhǔn)品、11-巰基十一烷酸(MUA)、單體甲基丙烯酸(MAA)、交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、引發(fā)劑2,2-偶氮雙(2-甲基丙脒)鹽酸鹽(AIBA)(美國(guó)Sigma-Aldrich公司),1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(阿拉丁試劑上海有限公司),結(jié)構(gòu)類似物5-羥色胺、1-咪唑乙酸、5-羥基吲哚乙酸、組胺酸(美國(guó)Sigma-Aldrich公司),其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純,使用前未經(jīng)純化處理,實(shí)驗(yàn)用水為18.3MΩ·cm超純水。

    1.2 主要儀器

    電化學(xué)工作站:荷蘭IVIUMTECHNOLOGIESBV公司;Ag/AgCl電極、鉑絲電極:上海辰華儀器有限公司;金電極:天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有限公司;電熱真空干燥箱:天津天宇機(jī)電有限公司;Eppendorf移液器:德國(guó)Eppendorf公司;超聲波清洗機(jī):寧波新芝生物科技股份有限公司;其林貝爾脫色搖床:江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司;AL-204分析天平:美國(guó)METTLER TOLEDO。

    1.3 方法

    1.3.1 金電極的處理

    用藥匙取少量Al2O3粉于麂皮上,加少量蒸餾水潤(rùn)濕,將清洗干凈的電極在麂皮上“8”字形打磨,打磨好金電極后,用蒸餾水沖洗,將金電極在1MH2SO4體系中進(jìn)行清洗,循環(huán)伏安法掃描電位為-0.2 V~1.2 V,穩(wěn)定后將金電極放入0.5MH2SO4體系中進(jìn)行活化,循環(huán)伏安法掃描電位為-0.2V~1.6V,掃描穩(wěn)定后活化完畢,H2SO4體系實(shí)驗(yàn)前均用N2除氧10min。

    1.3.2 分子印跡膜的制備

    將金電極放入1mM的MUA乙醇溶液中反應(yīng)過夜,清洗干凈后,加入400mMEDC、100mMNHS混合液(1∶1,v/v)中避光振蕩活化1 h,然后將金電極加入含有200mM的AIBA水溶液中反應(yīng)3 h,反應(yīng)完畢后,將金電極放入含有組胺(0.2mmol)、MAA(0.4mmol)、EGDMA(0.8mmol)及DMSO(5mL)的預(yù)聚合液中,氮?dú)獬?0min后,放入60℃反應(yīng)16 h,然后用甲醇/冰乙酸(9∶1,v/v)洗脫模板分子,制備得到分子印跡膜,應(yīng)用這種材料檢測(cè)組胺,非印跡膜的制備沒有加入組胺,其它方法同前。

    1.3.3 最佳pH的篩選

    將濃度為5 ng/mL的組胺溶液的pH分別調(diào)到4~ 12后,再將修飾好后的金電極分別浸泡10min,然后再進(jìn)行電化學(xué)表征。

    1.3.4 電阻抗(EIS)法表征

    將不同梯度濃度的組胺標(biāo)準(zhǔn)液(0.5、1.0、2.5、5.0、10、25、50ng/mL)分別與修飾好后的金電極反應(yīng)10min,每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)量3次,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立檢測(cè)范圍,計(jì)算出最低檢測(cè)限值。

    1.3.5 精密度實(shí)驗(yàn)

    通過修飾的金電極對(duì)5 ng/mL組胺進(jìn)行EIS表征,洗脫和再生5次后,觀察電阻抗的變化,評(píng)價(jià)該檢測(cè)方法的精密度。

    1.3.6 干擾實(shí)驗(yàn)

    應(yīng)用MIP膜、NIP膜對(duì)10倍濃度的干擾物與組胺的檢測(cè)進(jìn)行比較,評(píng)價(jià)MIP膜對(duì)組胺檢測(cè)的選擇性。

    2 結(jié)果

    2.1 最佳pH的選擇

    pH的變化對(duì)該傳感器的影響較大,隨著pH的變化EIS表征會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化,組胺在不同的pH形態(tài)會(huì)發(fā)生變化,組胺的等電點(diǎn)為6.9和10.4[17],當(dāng)pH>10.4時(shí),組胺以其天然的形態(tài)出現(xiàn),當(dāng)pH<6.9時(shí),組胺含有2個(gè)質(zhì)子,當(dāng)pH位于二者之間時(shí),組胺含有1個(gè)質(zhì)子。將濃度為5 ng/mL的組胺溶液的pH分別調(diào)到4~12后,與金電極反應(yīng)完畢后進(jìn)行電化學(xué)表征,見圖2。

    圖2 pH對(duì)基于MIP膜的電化學(xué)傳感器檢測(cè)組胺的影響Fig.2 ElectrocheMicalsensor responseof theMIP fliMin varying pH conditions

    pH位于7~9時(shí),電阻抗的變化明顯好于其他pH,pH位于8時(shí),達(dá)到最佳檢測(cè)效果,由此可見,含有1個(gè)質(zhì)子的組胺能夠很好的與MIP膜結(jié)合。

    2.2 吸附響應(yīng)實(shí)驗(yàn)

    應(yīng)用EIS對(duì)不同濃度組胺的表征如圖3所示。

    可見各個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的EIS響應(yīng)信號(hào)成梯度變化,根據(jù)EIS響應(yīng)信號(hào)的變化,繪制出了劑量響應(yīng)曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。

    由圖可以看出,劑量響應(yīng)曲線的形狀不是一條筆直的直線,而是一個(gè)典型的等溫結(jié)合反應(yīng)曲線,初始激烈的信號(hào)上升,隨后逐漸出現(xiàn)飽和平穩(wěn),將濃度進(jìn)行對(duì)數(shù)變換后,繪制出了標(biāo)準(zhǔn)曲線,公式為:y= 3.440lgx+1.283,R2=0.997,組胺的檢測(cè)范圍為:0.5ng/mL~ 50 ng/mL,檢測(cè)限值:0.5 ng/mL。檢測(cè)限值的計(jì)算方法根據(jù)IUPAC的要求:CL=Cn+tSn/(n)1/2,CL為最低檢測(cè)限,Cn為最低可檢測(cè)的濃度,t值選用的是95%可信區(qū)間范圍,n是檢測(cè)的樣品數(shù)(n=5),Sn是測(cè)量5個(gè)樣品的標(biāo)準(zhǔn)差。

    圖3 EIS對(duì)不同濃度組胺的表征圖Fig.3 EIS characterization of different concentrationsof histaMine

    圖4 電化學(xué)傳感器檢測(cè)組胺的響應(yīng)曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Response curveand calibration curveof the present electrocheMicalsensor for histaMine

    2.3 選擇性實(shí)驗(yàn)

    本實(shí)驗(yàn)分別用MIP膜、NIP膜修飾的金電極作為識(shí)別元件,檢測(cè)不同濃度的組胺水溶液,比較結(jié)果如圖5所示。

    圖5 MIP膜與NIP膜對(duì)組胺檢測(cè)的選擇性比較Fig.5 Selectivity coMparison ofMIP filMand NIP filMfor histaMine

    由圖可以看出,MIP膜對(duì)組胺的選擇性明顯好于NIP膜,說明制作的MIP膜對(duì)組胺有吸附作用。應(yīng)用MIP膜、NIP膜對(duì)10倍濃度的干擾物與組胺的檢測(cè)進(jìn)行比較如圖6所示。

    圖6 組胺與結(jié)構(gòu)類似物的電阻抗變化的比較Fig.6 The iMpedanceshiftof histaMineand structuralanalogues

    MIP膜對(duì)組胺的選擇性好,特異性高。

    2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

    通過修飾的金電極對(duì)5 ng/mL組胺進(jìn)行EIS表征,洗脫和再生5次后,電阻抗的變化如圖7所示。

    圖7 連續(xù)測(cè)定5 ng/ML組胺的EIS表征圖Fig.7 EIS response for successive detectionsof 5 ng/MLof histaMine

    第1次與第5次檢測(cè),電阻抗變化很小,表明該MIP膜的精密度高、穩(wěn)定度好。

    3 討論

    通過對(duì)檢測(cè)條件的優(yōu)化,制備了高特異性快速響應(yīng)的分子印跡電化學(xué)傳感器,建立了檢測(cè)組胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線,最低檢測(cè)限為:0.5 ng/mL,檢測(cè)范圍:0.5 ng/mL~50 ng/mL。選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,該材料對(duì)結(jié)構(gòu)類似物無明顯的交叉反應(yīng)性,并且洗脫和再生5次后仍對(duì)組胺有吸附性,還可以進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,提高分子印跡膜的穩(wěn)定性,該方法可作為快速檢測(cè)食品中組胺的方法之一。

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    ElectrocheMical Sensor for the Detection of HistaMine Based on Molecularly Imprinted Polymer Film

    JIANGSui-yi,NINGBao-an,BAIJia-lei,PENGYuan,ZHANGNa,GAOZhi-xian*
    (Tianjin Key LaboratoryofRisk Assessmentand Control Technology for Environmentand Food Safety,Institute ofHealth and EnvironmentalMedicine,Tianjin 300050,China)

    In thepurposeofproviding fastdetection technologyandequipment,adetectionmethod forhistaminein water samplesusing electrochemical sensorwas established.Molecularly imprinted polymer(MIP)filmswere preparedon thegoldelectrode,andwerecharacterizedbyelectrochemicalmethod.Electrochemicalmethod for the detection ofhistaminewasestablished.TheminimuMdetection limitof theestablishedmethodwas0.5 ng/mL.The sensing techniqueallows for thedetection ofhistamine in thewide range froM0.5 ng/mL to50 ng/mLand detection time lessthan30min.Theestablisheddetectionmethod forhistamineinwatersensitive,accurate,andprecise.

    electrochemicalsensing technology;histamine;molecularly imprinted polymer(MIP)films;food fastdetection technology

    10.3969/j.issn.1005-6521.2014.18.019

    2014-09-15

    國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2012AA101604)

    姜隨意(1982—),男(漢),醫(yī)師,在讀碩士研究生,研究方向:食品安全關(guān)鍵技術(shù)研究。

    *通信作者

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