尿液miR-30a-5p預(yù)測(cè)激素治療局灶節(jié)段性腎小球硬化的療效

張婉芬　陳慧梅　張昌明　施少林　劉志紅

原發(fā)性局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)是臨床常見的腎小球疾病病理類型。國(guó)內(nèi)外的研究均顯示FSGS是引起腎病綜合征及導(dǎo)致終末期腎病(ESRD)的主要病因之一。糖皮質(zhì)激素是目前治療FSGS的首選藥物，但成人FSGS患者激素治療反應(yīng)較差，完全緩解(CR)率<30％[1]。FSGS的腎小球局部病變性質(zhì)不均一，對(duì)治療的反應(yīng)和預(yù)后也不相同[2]。目前臨床主要通過(guò)治療8周時(shí)尿蛋白水平判定疾病的緩解情況，標(biāo)準(zhǔn)單一。對(duì)于激素治療反應(yīng)差的患者，8周后激素?zé)o效更換治療方案耽誤了治療的最佳時(shí)機(jī)。而尿蛋白水平受飲食、尿量、尿中細(xì)胞、保存方式等影響較大，且不是一個(gè)疾病特異性的標(biāo)志物。因此，找尋預(yù)測(cè)FSGS患者激素治療反應(yīng)，或提前判斷FSGS患者對(duì)激素治療反應(yīng)的標(biāo)志物具有重要意義。

近來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，血液及尿液等多種體液中miRNAs的種類及變化與很多生理及病理過(guò)程有關(guān)，能作為判斷疾病狀態(tài)的生物標(biāo)志物[3-5]。我們之前的研究證實(shí)尿液miR-196a、miR-30a-5p和miR-490的水平與FSGS疾病的活動(dòng)性呈正相關(guān)，大量蛋白尿的FSGS患者尿中miRNAs水平顯著高于緩解的患者[6]。本研究進(jìn)一步通過(guò)回顧性研究和前瞻性研究相結(jié)合，分析尿液miR-196a、miR-30a-5p和miR-490水平與FSGS激素治療反應(yīng)的關(guān)系，并與傳統(tǒng)的標(biāo)志物尿蛋白進(jìn)行比較，判斷尿液miRNAs作為預(yù)測(cè)治療反應(yīng)的新型標(biāo)志物的可能性，從而協(xié)助指導(dǎo)臨床實(shí)踐。

對(duì)象和方法

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本研究采用回顧性隊(duì)列研究和前瞻性隊(duì)列研究?jī)刹糠衷u(píng)估m(xù)iR-30a-5p、miR-196a和miR-490對(duì)FSGS患者激素治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)作用。所有患者來(lái)自于南京軍區(qū)南京總醫(yī)院腎臟科，入選標(biāo)準(zhǔn)包括：(1)經(jīng)臨床與腎活檢確診的原發(fā)性FSGS，排除因其他疾病造成的繼發(fā)性FSGS；(2)所有患者為初治患者，尿蛋白定量>3.5 g/d ；(3)年齡在16～65歲之間；(4)血清肌酐<265.2 μmol/L；(4)無(wú)嚴(yán)重其他臟器或系統(tǒng)疾病。激素治療效果評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：(1)CR組：尿蛋白定量<0.3 g/d，血清肌酐(SCr)水平正常，血清白蛋白水平(Alb)>35 g/L；(2)未完全緩解(non-CR)組包括部分緩解(PR)組和治療無(wú)效(NR)組：PR指尿蛋白定量在0.3～3.5 g/d之間，且SCr水平穩(wěn)定(SCr變化<25％)；NR指在接受1 mg/(kg·d)的足量激素治療(最大劑量60 mg/d)16周后患者尿蛋白定量仍>3.5 g/d。

回顧性研究共納入139例FSGS患者，所有患者均接受1 mg/(kg·d)的足量激素治療(最大劑量60 mg/d)8周，若治療8周時(shí)患者達(dá)CR，則激素逐漸減量，若8周時(shí)未達(dá)到CR，則足量激素治療延長(zhǎng)至16周，此時(shí)再次評(píng)估患者的治療效果。其中68例患者經(jīng)治療CR，27例PR，44例NR。因PR組例數(shù)較少，故在正式分析時(shí)將后兩組合并為non-CR組(71例)。分析治療前尿液miRNAs水平與激素療效的關(guān)系。另外共完成了兩項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究：一項(xiàng)入選了55例初治的FSGS患者，接受60 mg/d的激素治療8周，治療結(jié)束時(shí)據(jù)患者蛋白尿的水平評(píng)估治療效果，其中33例經(jīng)治療達(dá)CR，22例non-CR。比較尿液miRNAs水平在激素治療前后的變化，并比較兩組間變化的差別。另一項(xiàng)研究則入選了22例初治的FSGS患者，接受60 mg/d的激素治療8周，每4周定期隨訪，8周后 11例達(dá)到了CR，11例non-CR。觀察兩組miRNAs水平隨治療的變化趨勢(shì)及與尿蛋白消長(zhǎng)的關(guān)系。

入選時(shí)詳細(xì)記錄所有患者性別、年齡、尿蛋白定量、SCr、總膽固醇(CH)、三酰甘油(TG)等臨床資料。每個(gè)隨防點(diǎn)及治療結(jié)束時(shí)收集尿液，檢測(cè)尿液中尿蛋白及miRNAs的水平?；颊叩乃袠?biāo)本留取都取得本人的同意，經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

尿液RNA提取方法患者留取隨機(jī)尿液樣本，樣本留取后4h內(nèi)進(jìn)行處理，1 500 r/min離心10分鐘，留取尿液上清-80℃保存。單個(gè)尿液樣本miRNAs提取方法：取300 μl樣品加入到100 μl DEPC水中，充分混勻后加入等體積的酸性酚(PH=4.7～5.5)和氯仿，酸性酚氯仿體積1∶ 1，進(jìn)行抽提，后續(xù)抽提方法同血清中提取RNA方法一致[3,7]，RNA用10 μl DEPC水溶解，-80 ℃保存。

miRNAs定量PCR檢測(cè)(qRT-PCR)采用探針?lè)z測(cè)尿中的miRNAs的含量，探針購(gòu)于Applied Biosystems(Foster City,CA,USA)。逆轉(zhuǎn)錄酶及taq聚合酶購(gòu)于takara。qRT-PCR采用ABI Prism 7900 定量PCR儀器進(jìn)行檢測(cè)。逆轉(zhuǎn)錄使用RNA 2 μl，所得到的cDNA于-20℃保存?zhèn)溆?。qRT-PCR每反應(yīng)體系使用不稀釋的cDNA 1 μl。尿液miRNAs選用絕對(duì)定量的方法計(jì)數(shù)[8-10]。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。臨床指標(biāo)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；臨床指標(biāo)兩組比較采用t檢驗(yàn)；miRNAs表達(dá)水平的兩組比較采用nonparametric Mann-Whitney U-test檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)評(píng)估m(xù)iRNAs區(qū)分兩治療反應(yīng)組的價(jià)值。

結(jié)　　果

尿液miR-30a-5p水平對(duì)回顧性隊(duì)列FSGS患者激素治療的預(yù)測(cè)效應(yīng)在本組研究中，兩組患者治療前性別、年齡，尿蛋白、SCr、CH水平無(wú)差異(表1)。qRT-PCR結(jié)果顯示，治療前尿液miR-30a-5p水平在未完全緩解組和完全緩解組存在顯著性差異(P=0.03)，而miR-196a和miR-490的水平在兩組之間無(wú)顯著性差異(圖1A)。

表1　回顧性研究中FSGS患者臨床指標(biāo)基線水平

ROC曲線分析顯示，治療前尿液miR-30a-5p的水平能顯著區(qū)分未完全緩解組和完全緩解組，曲線下面積(AUC)為0.628(95％CI 0.536～0.721，P=0.03；圖1B)。而治療前尿液miR-196a和miR-490的水平則不能區(qū)分CR組和non-CR組。這部分研究結(jié)果表明，治療前尿液miR-30a-5p的水平在一定程度上具有對(duì)FSGS患者激素治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)作用。

圖1　回顧性研究中完全緩解組和未完全緩解組治療前尿液miRNAs的水平

尿液miR-30a-5p水平預(yù)測(cè)前瞻性隊(duì)列FSGS患者激素治療的反應(yīng)前瞻性55例初治FSGS患者隊(duì)列研究，給予足量激素治療8周，33例患者經(jīng)治療達(dá)CR，而22例患者未達(dá)到CR，治療前兩組間患者的年齡、性別、尿蛋白定量、SCr、CH的水平無(wú)顯著差異(表2)。結(jié)果顯示，激素治療CR的33例FSGS患者，尿液miR-30a-5p的表達(dá)水平隨著病情的緩解明顯下降(P<0.001)；而激素治療未完全緩解的22例FSGS患者，尿液miR-30a-5p在治療前后沒(méi)有明顯的變化(P>0.05)(圖2)。

圖2　FSGS患者治療前后尿液miR-30a-5p的變化

尿液miR-30a-5p對(duì)激素治療反應(yīng)的指示作用先于蛋白尿水平的變化在另一組22例初治的FSGS患者，給予足量激素治療8周后，11例完全緩解，11例未完全緩解，治療前兩組間患者的年齡、性別、尿蛋白的水平無(wú)顯著差異(表2)。在治療前(0周)完全緩解組和未完全緩解組的miR-30a-5p水平無(wú)明顯差異(P=0.48)，尿蛋白水平無(wú)明顯差異(P=0.06)。治療4周、8周時(shí)兩組miR-30a-5p水平存在明顯差異(P=0.008；P=0.03)，尿蛋白水平存在明顯差異(P=0.03；P<0.001)，具體見表2。

此外，為避免有個(gè)別個(gè)體的蛋白尿絕對(duì)水平下降顯著，而對(duì)整體的絕對(duì)蛋白尿水平造成分析上的偏差，選擇用相對(duì)于初始的相對(duì)蛋白尿水平和相對(duì)miR-30-5p水平來(lái)分析變化趨勢(shì)。以治療前水平作標(biāo)準(zhǔn)化處理后分析，治療4周時(shí)相對(duì)miR-30a-5p水平在完全緩解組顯著低于未完全緩解組，存在明顯差異(P=0.03)，而此時(shí)尿蛋白水平在兩組之間未見明顯差異(P=0.29)。治療在8周時(shí)，兩組間的相對(duì)miR-30a-5p的水平和尿蛋白水平均存在明顯差異(P=0.003，P<0.001)(圖3)。這部分結(jié)果顯示，在完全緩解的患者，miR-30a-5p下降的速度早于蛋白尿的變化，進(jìn)一步證實(shí)了尿液miR-30a-5p水平對(duì)FSGS患者激素治療的效果具有預(yù)測(cè)作用。

表2　前瞻性研究中FSGS患者基線及治療中指標(biāo)水平

圖3　激素治療過(guò)程中CR組和non-CR組尿蛋白和尿液miR-30a-5p水平變化的比較

討　　論

在之前的研究中我們發(fā)現(xiàn)尿液miR-196a、miR-30a-5p和miR-490的水平與FSGS患者疾病的活動(dòng)性相關(guān)，臨床FSGS疾病的活動(dòng)性根據(jù)尿蛋白水平判斷，因此，本文進(jìn)一步的究分析尿液miRNAs水平與疾病預(yù)后及激素治療效果之間的關(guān)系。首先通過(guò)回顧性研究發(fā)現(xiàn)，尿液miR-30a-5p治療前的水平能夠區(qū)分CR組和non-CR組，能預(yù)測(cè)激素治療的反應(yīng)，而尿液miR-196a和miR-490則不能。再進(jìn)一步前瞻性的研究發(fā)現(xiàn)，激素治療后FSGS CR組尿液miR-30a-5p的水平較治療前顯著下降，而non-CR組治療前后無(wú)顯著差異。最后發(fā)現(xiàn)在CR組，尿液miR-30a-5p的水平不僅隨著激素治療的過(guò)程逐漸下降，而且在4周時(shí)即可體現(xiàn)出與non-CR組的差別，而此時(shí)尿蛋白水平在兩組間無(wú)顯著差異。研究結(jié)果證實(shí)，尿液miR-30a-5p的水平不僅能在治療前預(yù)示疾病的預(yù)后，而且能反映激素治療的效果，能作為判斷FSGS激素治療和疾病預(yù)后的很好的標(biāo)志物。

既往研究證實(shí)，蛋白尿、SCr、治療無(wú)效及間質(zhì)纖維化為成人原發(fā)性FSGS腎臟遠(yuǎn)期預(yù)后的危險(xiǎn)因素[11]。因此在回顧性研究中，F(xiàn)SGS患者均為初治的患者，在完全緩解組和未完全緩解組兩組間初治的蛋白尿水平、SCr水平無(wú)顯著性差異，避免了蛋白尿水平、SCr水平差異造成的治療反應(yīng)的差別。在研究中發(fā)現(xiàn)，同樣是大量蛋白尿的患者，CR組和non-CR組miR-30a-5p的水平在治療前即存在明顯差異，表明尿液miR-30a-5p對(duì)激素治療效果具有一定的預(yù)測(cè)作用，可能是影響FSGS遠(yuǎn)期預(yù)后的重要因素。miR-30a-5p與miR-196a、miR-490相比，可能在疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著更為關(guān)鍵的作用。

在前瞻性的研究中，尿液miR-30a-5p的水平隨著疾病的緩解在激素治療后比治療前顯著地降低了；而non-CR的患者，其水平在治療前后無(wú)明顯差異。這一結(jié)果表明，治療8周時(shí)，尿液miR-30a-5p水平的變化與尿蛋白的變化一致，并沒(méi)有體現(xiàn)出與尿蛋白的差別。但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，治療4周相對(duì)治療前水平，在CR組和non-CR組尿蛋白水平尚未出現(xiàn)明顯差異時(shí)，而尿液miR-30a-5p下降的程度在兩組間已經(jīng)出現(xiàn)明顯的差別，這種變化趨勢(shì)與尿蛋白變化存在明顯差別，提示尿液miR-30a-5p的變化快于尿蛋白的變化。臨床通常在治療8周時(shí)通過(guò)尿蛋白的水平判斷患者激素治療的效果，miR-30a-5p能提前判斷FSGS患者對(duì)激素治療的反應(yīng)，為臨床實(shí)踐提供了一個(gè)新的方法。

尿液miRNAs和其他體液中的循環(huán)miRNAs一樣，都是在疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中由組織、細(xì)胞產(chǎn)生的[12,13]。通常細(xì)胞內(nèi)的miRNAs從受損的細(xì)胞中被動(dòng)的漏出或是細(xì)胞在受到外界刺激后主動(dòng)釋放進(jìn)入循環(huán)中。釋放出的miRNAs被包裹在微囊泡中[14,15]或與高密度脂蛋白結(jié)合從而保持在循環(huán)中的穩(wěn)定性[16,17]。miR-196a、miR-30a-5p和miR-490在組織中的表達(dá)和作用也從另一方面支持了它們作為FSGS疾病標(biāo)志物的潛能。miR-30家族在人體腎臟的含量明顯高于心、肺、肝、脾、結(jié)腸[18]。之前的研究，包括我們自己的研究發(fā)現(xiàn)[19,20]， miR-30 家族在FSGS患者腎小球的足細(xì)胞中顯著表達(dá)，其功能的缺失或表達(dá)下降可導(dǎo)致足細(xì)胞的損傷和凋亡，進(jìn)一步造成腎小球硬化和蛋白尿的產(chǎn)生；激素治療能夠減輕由轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β，脂多糖等刺激因素造成的足細(xì)胞中miR-30a家族的下降，激素對(duì)miR-30家族的調(diào)控作用可能與減少Notch1通路的激活及減輕足細(xì)胞損傷有關(guān)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)治療前尿液miR-30a-5p的水平CR組高于non-CR組，目前尚不能清楚地闡釋其機(jī)制。可能的原因與兩組患者本身對(duì)激素治療反應(yīng)不同的原理有關(guān)。對(duì)于該指標(biāo)在治療后迅速下降，我們推測(cè)，激素治療后，治療有效組足細(xì)胞中miR-30a-5p水平得到了維持，減少了足細(xì)胞對(duì)其主動(dòng)或被動(dòng)的釋放，從而尿中miR-30a-5p的水平顯著下降。而治療無(wú)效組，由于足細(xì)胞損傷未得到很好的修復(fù)，足細(xì)胞釋放miR-30a-5p的水平未明顯減輕，從而治療結(jié)束時(shí)下降的水平不如治療有效組。這些研究證實(shí)了miR-30家族在FSGS的發(fā)病中起著關(guān)鍵的作用，也從側(cè)面支持了miR-30a-5p能作為判斷FSGS激素治療效果的標(biāo)志物。miR-196a在腎臟中表達(dá)豐富，但是其在腎臟中的功能還不清楚，研究認(rèn)為其與病毒免疫、細(xì)胞的發(fā)育和分化有關(guān)[21,22]。目前還沒(méi)有研究證實(shí)miR-490在腎臟中的表達(dá)與功能。因此盡管之前的研究發(fā)現(xiàn)尿液miR-196a和miR-490的水平隨著疾病的緩解而下降[6]，但是他們?cè)贔SGS疾病中的作用與miR-30a-5p可能存在差別。本研究結(jié)果提示了不同的miRNAs在FSGS疾病中所存在的差別，但是很難解釋miRNAs在FSGS，特別是miR-30a-5p在疾病發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的作用，因此，還需要更多體內(nèi)和體外的研究來(lái)進(jìn)一步幫助我們發(fā)現(xiàn)其中的內(nèi)在的聯(lián)系與差別。

本研究也存在一些不足之處。首先，我們研究的尿液miRNAs不全面，可能存在其他的miRNAs對(duì)疾病的預(yù)后有更好的預(yù)測(cè)作用。另外，如果多個(gè)miRNAs的組合，彌補(bǔ)了個(gè)體間的差異，比單個(gè)miRNAs作為疾病的標(biāo)志物更有優(yōu)越性[23]。其次，我們?cè)谇罢靶匝芯恐羞x擇的病例較少，因此，影響了對(duì)這幾個(gè)miRNAs的變化與FSGS激素治療之間的聯(lián)系更深入的討論。盡管研究發(fā)現(xiàn)miR-30a-5p對(duì)激素治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)作用，但是沒(méi)有提供一個(gè)具體的臨界值為臨床診斷服務(wù)。因此，進(jìn)一步探尋FSGS患者miR-30a-5p在尿液中的變化及其調(diào)控機(jī)制，對(duì)于提高FSGS發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)和尿液miRNAs的臨床應(yīng)用具有重要的意義。

總之，尿液miR-30a-5p的水平不僅能在治療前預(yù)示激素治療的效果，而且在治療中的變化提前于尿蛋白的變化，并在治療后隨著疾病的緩解而下降，是作為預(yù)測(cè)FSGS激素治療反應(yīng)和疾病預(yù)后的良好的標(biāo)志物。

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