一株枯草芽孢桿菌對(duì)芘的降解特性及代謝途徑的研究

姚 俊，喻 嬋，靳競(jìng)男

（北京科技大學(xué)土木與環(huán)境工程學(xué)院環(huán)境與能源國(guó)際合作基地，北京100083）

多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是常見(jiàn)的一類(lèi)環(huán)境污染物［1－2］，廣泛分布于水體、空氣及土壤中。由于其在環(huán)境中的半衰期較長(zhǎng)和致癌、致畸、致突變的性質(zhì)而日益受到人們的重視［3］。PAHs具有較低的水溶性［4］，高分子量的PAHs在環(huán)境中的存留時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致這類(lèi)化合物在環(huán)境中很難被去除［5］。美國(guó)環(huán)保局在20世紀(jì)80年代初將16種未帶分支的PAHs確定為環(huán)境中的優(yōu)先控制污染物［6］。利用微生物去除環(huán)境中的PAHs因費(fèi)用低、易操作及不造成二次污染而逐漸成為研究熱點(diǎn)［7］。

作者從大港油田原油樣品中篩選獲得1株可以以芘（代表性PAHs）作為唯一碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)的菌株，對(duì)其降解特性和降解產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)定，進(jìn)一步提出了該菌株對(duì)芘的降解代謝途徑。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 樣品及培養(yǎng)基

原油樣品取自大港油田港西區(qū)塊58－8－3＃油井。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（g·L－1）［8］：（NH4）2SO43，KH2PO40.5，Na2HPO4·12H2O 1.26，MgSO4· 7H2O 0.54，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.05，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03，MnSO4·H2O 0.015，ZnSO4·7H2O 0.024，CoCl2· 6H2O 0.366，調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4。固體培養(yǎng)基中添加2%的瓊脂，121℃滅菌30min。

LB培養(yǎng)基（g·L－1）：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，調(diào)節(jié)pH值至7.0。固體培養(yǎng)基中添加2%的瓊脂，121℃滅菌30min。

1.2 菌種篩選

將樣品以2%的接種量接種于以芘為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，好氧條件下于28℃、180r·min－1搖床培養(yǎng)7d，相同條件下轉(zhuǎn)接1次。采用稀釋涂平板法涂于以芘為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，于28℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)7d形成單菌落。挑取生長(zhǎng)迅速、邊緣整齊的菌落接入無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，搖瓶復(fù)篩，得到目的菌株。

1.3 芘降解菌株的鑒定

將目的菌株在28℃LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取1.5mL培養(yǎng)液以12 000r·min－1離心，收集菌體。采用OMEGA公司提供的細(xì)菌基因組DNA小量快速提取試劑盒提取該菌株的總DNA，將其置于－20℃保存，備用。

以總DNA為模板，采用引物27F（5′－AGAGTT TGATCCTGGCTCAG－3′）和1492R（5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′）［9］進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系20μL，其中PCR mix 10μL，總DNA 0.5μL，正、反引物各0.4μL，ddH2O 8.7μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

16SrDNA序列由華大基因公司測(cè)定。測(cè)定結(jié)果在GenBank上與已知種屬的16SrDNA序列進(jìn)行Blast比對(duì)［10］，利用Mega4對(duì)獲得的同源性序列進(jìn)行分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.4 菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

目的菌株經(jīng)LB液體培養(yǎng)基活化后，取1mL菌液接種于芘濃度為100mg·L－1的50mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，待OD600≈0.25時(shí)，以2%的接種量接入以芘為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于28℃、180r ·min－1進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，以未接菌株的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基為空白，每2d測(cè)1次OD600。

1.5 芘降解率的測(cè)定

活化菌株在芘濃度為100mg·L－1的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，待OD600≈0.25時(shí)，以2%的接種量接入以芘為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于28℃、180r· min－1進(jìn)行培養(yǎng)。取5mL正己烷與5mL菌液混合，超聲數(shù)分鐘后，靜置約10min分層。收集上層有機(jī)相和下層水相。重復(fù)此操作2次，合并有機(jī)相，棄下層水相。將有機(jī)相過(guò)無(wú)水硫酸鈉柱除去水分，蒸發(fā)濃縮至2mL，進(jìn)行GC－MS分析。

1.6 芘降解代謝產(chǎn)物的測(cè)定

GC－MS條件：進(jìn)樣口無(wú)分流模式，溫度250℃，HP－5彈性石英毛細(xì)管色譜柱（30m×0.25mm，0.25 μm），柱子流量為1.1mL·min－1，爐溫60℃保持1 min，以15℃·min－1升到150℃保留1min，再以6℃·min－1升到320℃保留10min。進(jìn)樣口和檢測(cè)器的溫度分別為250℃和300℃。載氣（氦氣）流速為1.1mL·min－1。空白樣品為未接菌的樣品。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的鑒定

經(jīng)過(guò)富集、馴化及純化，篩選得到1株芘降解菌株，命名為USTB－Y。菌體形態(tài)為桿狀，菌落呈圓形，邊緣呈鋸齒狀，中間凸起，乳黃色，表面光滑，濕潤(rùn)。

將測(cè)得的16SrDNA序列在GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)，獲得的同源性序列均為Bacillus屬，其中與Bacillus amyloliquefaciens strain BC7的同源性高達(dá)97%。進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，確定該菌株在所屬種屬中的親緣關(guān)系，如圖1所示。

圖1 芘降解菌USTB－Y的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic positions of USTB－Y on 16SrDNA analysis

從圖1可以看出，USTB－Y和Bacillus amyloliquefaciens strain BC7的親緣關(guān)系最近，可以推斷此菌株屬于芽孢桿菌屬。

2.2 菌株USTB－Y對(duì)芘的降解特性（圖2）

圖2 菌株USTB－Y的生長(zhǎng)曲線及芘降解率隨時(shí)間變化曲線Fig.2 The growth curve of strain USTB－Y and the variation curve of pyrene degradation rate with time

從圖2可以看出，菌株USTB－Y在以芘為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)經(jīng)歷延遲期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期及衰亡期這4個(gè)時(shí)期，在第8d時(shí)生長(zhǎng)速率達(dá)到最快，OD600值為0.206，較以LB為培養(yǎng)基時(shí)的生長(zhǎng)速率慢，可能是由于無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基是一種缺陷型培養(yǎng)基，細(xì)菌在此培養(yǎng)基中生長(zhǎng)能力較差。

從圖2還可以看出，菌株USTB－Y逐漸降解芘，在16d時(shí)對(duì)芘的降解率高達(dá)約56%，由于此時(shí)培養(yǎng)基中的菌株大部分處于衰亡期，所以基本認(rèn)為測(cè)定的降解率為最高。表明，USTB－Y是1株能夠有效降解芘的菌株。

2.3 芘降解代謝產(chǎn)物的測(cè)定

通過(guò)GC－MS分析，檢測(cè)到菌株USTB－Y對(duì)芘的降解過(guò)程中產(chǎn)生的一系列代謝產(chǎn)物，如圖3所示。

從圖3可以看出，檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物有1－羥基芘、芘酮、鄰苯二甲酸酯和1－羥基苯。

根據(jù)所檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物，參考Bacillus amyloliquefaciens strain BC7，推測(cè)菌株USTB－Y降解芘可能存在的代謝途徑，如圖4所示。

圖3 菌株USTB－Y降解芘的代謝產(chǎn)物Fig.3 The metabolites formed from pyrene utilization by strain USTB－Y

圖4 菌株USTB－Y降解芘的可能代謝途徑Fig.4 Proposed pathway for the degradation of pyrene by strain USTB－Y

從圖4可以看出，菌株USTB－Y以芘為唯一碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)的過(guò)程中，芘的芳香環(huán)上4位的碳首先受到單加氧酶或雙加氧酶的攻擊，形成水二醇；進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為1－羥基芘，接著轉(zhuǎn)化為芘酮或其它代謝產(chǎn)物；再進(jìn)一步降解形成鄰苯二甲酸酯，轉(zhuǎn)化為鄰苯二甲酸，最終進(jìn)入三羧酸循環(huán)被完全降解。

3 結(jié)論

自大港油田港西區(qū)塊58－8－3＃油井原油樣品中篩選得到1株能以芘為唯一碳源和能源生長(zhǎng)的菌株USTB－Y。形態(tài)鑒定及16SrDNA鑒定表明，此菌株屬于芽孢桿菌屬，與Bacillus amyloliquefaciens strain BC7的同源性高達(dá)97%。對(duì)其生長(zhǎng)曲線及對(duì)芘的降解率測(cè)定表明，在以芘為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)16d后，芘的降解率高達(dá)56%，被認(rèn)為是對(duì)芘具有高效降解效果的菌株。進(jìn)一步對(duì)菌株USTB－Y降解芘的代謝產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定，提出了該菌株降解芘的可能代謝途徑。

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