TUNEL法和SCGE法評價奶牛性控凍精DNA損傷

鄭 飛 駱新榮 賈發(fā)青 高慶華， 韓春梅，*

(1 塔里木大學動物科學學院， 新疆 阿拉爾 843300)(2 新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室， 新疆 阿拉爾 843300)

前言

性控凍精的產業(yè)化應用對畜牧業(yè)發(fā)展，特別是奶牛業(yè)的發(fā)展產生了重大而深遠的影響。隨著性控凍精生產技術的日漸成熟，性控凍精也逐步向茸鹿、奶山羊等限性性狀家畜廣泛推廣。在未來的現代化畜牧業(yè)，性控凍精將有可能替代常規(guī)凍精，使家畜品種改良，品系化雜交繁育進入一個全新的時代。

在性控凍精在制作過程中，精液的處理會對精子產生各種影響，從而造成精子DNA的較大程度損傷[1，2]，由于受精時不完全依賴于精子DNA完整性，即便是DNA受損的精子仍可保持受精潛能，產生表型健康的性控后代，但性控凍精DNA損傷會對后代的遺傳穩(wěn)定性的產生遠期影響，即使受精后損傷的DNA有一定的自修復能力[1]。因此，性控凍精的生物安全性應被關注。

TUNEL法(terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling, 脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法)是檢測細胞凋亡早期過程中細胞核DNA完整性的有效方法。單細胞凝膠電泳(single single-cell gel electropherosis,SCGE)又稱彗星法，是一種比較靈敏簡便的檢測DNA損傷程度的方法。本實驗通過TUNEL法和SCGE法分別對性控凍精DNA的完整性進行檢測，對比兩種方法檢測結果對性控凍精DNA的損傷程度的評價。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

X/Y種畜(天津)有限公司生產規(guī)格為0.25 mL的性控奶牛細管凍精，種公牛號分別為12200145、12200171、12200176，精子數約230萬，活率40～45%。三頭公牛常規(guī)凍精每管精子數2 000萬，活率35～40% 。

1.2 試劑

TUNEL試劑盒購自羅氏公司；低熔點瓊脂糖，十二烷基肌氨酸鈉，蛋白酶K，DAPI購自Promege公司，其它試劑購自南京化學試劑公司。DYY-6B型電泳儀為北京六一儀器廠，TS100-F型熒光顯微鏡產自日本。

1.3 方法

1.3.1 TUNEL法

嚴格按照試劑盒說明書進行檢測，DAPI染色后在藍色背景下觀察。若為藍色，則為陰性，DNA無損傷；若有綠色熒光，則為陽性，DNA受損。采用雙盲法進行計數，隨機觀察100個細胞，每個樣本重復5次，取平均值作為檢測結果。

1.3.2 SCGE法

采用實驗室已建立的SCGE法[3]，將精子密度調至2×106個/ ml左右，與1%的低熔點瓊脂糖混勻，鋪于被常熔點瓊脂糖包被的載玻片上，4 ℃裂解1.5 h，加入預冷的DTT 4 ℃作用1 h后，用含有蛋白酶K的細胞緩沖液消化過夜。4 ℃，15 V，150 mA電泳30 min，加入Tris-HCl，4 ℃中和2次，每次10 min。-20 ℃預冷的無水乙醇作用10 min后，吖啶橙染色，熒光顯微鏡下觀察，觀察到彗星形狀為陽性，反之為陰性。采用雙盲法進行計數，隨機觀察50個細胞，每個樣本重復5次，取平均值作為檢測。

1.4 統(tǒng)計學分析

所有數據均采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析，以平均數±標準差表示。對性控凍精和常規(guī)凍精的DNA損傷率進行配對t檢驗，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果

由表1可知TUNEL法檢測所得性控凍精DNA損傷陽性率高出常規(guī)凍精約32個百分點，差異極顯著。SCGE法對性控凍精DNA損傷的檢測結果相對于常規(guī)凍精比較高出約31個百分點，差異極顯著。故性控凍精的DNA損傷程度極顯著高于常規(guī)凍精。

表1 TUNEL法與SCGE法對性控凍精DNA損傷的檢測

A常規(guī)凍精

B性控凍精

A常規(guī)凍精

B性控凍精

3 討論

3.1 DNA損傷檢測結果

本實驗成功的用TUNEL法和SCGE法檢測了性控凍精DNA的損傷程度，結果與常規(guī)凍精相比均出現了差異極顯著的陽性率，說明精子核DNA受到損傷。結果與駱新榮等研究結果相符[3]。

相對于常規(guī)凍精，流式細胞儀分離得到的奶牛精子會受到更大程度的損傷，其功能和受精力也受到非常大的影響[4-5]。在使用流式細胞儀分選精子時，精子受到高度稀釋、高壓、電場等的影響[6-7]，尤其是核染色后，被激光照射會對精子DNA產生很大的損傷[8]。分選后的單性精子會處于極活躍狀態(tài)，其興奮性、運動力極強，故導致其存活時間相對較短。同時，在制作冷凍精液的過程中，精液的稀釋、離心、冷凍和保護劑的添加量等都能使精子DNA的完整性受到影響。趙宏遠等研究發(fā)現冷凍后的山羊精子DNA損傷程度較新鮮精液的有明顯升高，差異極顯著[9]。劉奕等人研究發(fā)現染色對精子DNA的完整性有一定的影響，但與正常精子相比差異不顯著[10]。閆永健等人發(fā)現UVB照射對斑馬魚的早期胚胎發(fā)育有明顯影響，同時隨著照射時間的增加，胚胎對UVB的耐受力也增強[11]。雖然染色，激光照射等單個因素對精子的作用可能不明顯，但同時作用后精子的DNA損傷就會大幅提升。有研究表明細胞的自身修復能力很強[12-13]，不嚴重影響受精率、出生重等指標，但我們實驗室研究發(fā)現性控凍精的后代的初生重、受胎率等相對于常規(guī)凍精還是有所降低[14]。這可能與精子細胞受損傷的程度和自身修復能力有一定關系[1]。如果使用常規(guī)精液的冷凍程序(慢速降溫、中性稀釋液)，相當數量的精子會在冷凍前死亡，故通過改變分選后精液的冷凍程序，有望提高凍后精子的活率，降低當前每管凍精的精子數量，達到降低成本的目的。

3.2 TUNEL法和SCGE法對性控凍精DNA的損傷程度的評價

在人類男性不孕癥的研究中，很多運用TUNEL法和SCGE法對精子DNA的完整性進行檢驗。Sergerie, M等比較了TUNEL法、SCSA法(精子染色質結構分析 sperm chromatin structure assay)和SCGE法三種方法的檢測結果，認為TUNEL法和SCGE法能更好的檢測出精子DNA單鏈及雙鏈的斷裂情況，而SCSA能檢測精子DNA在組裝壓縮過程發(fā)生的變化[4]。O'Flaherty C等分別用TUNEL法、SCSA法和SCGE法檢測睪丸癌和霍奇金淋巴瘤病人精子DNA的損傷情況，發(fā)現三種方法中SCGE法優(yōu)于前兩種，是檢測睪丸癌病人精子DNA組裝過程染色質的變化情況最好一種方法[15]。

本實驗用SCGE法檢測性控凍精DNA的損傷情況，結果與TUNEL法相似，說明SCGE法和TUNEL檢測均可作為評價精子質量的有效方法。

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