MYCT1新轉(zhuǎn)錄本的克隆與表達(dá)分析

符爽，孫開來，富偉能

（中國醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)教研室，沈陽110001；2.附屬盛京醫(yī)院血液研究室，沈陽110022）

MYCT1新轉(zhuǎn)錄本的克隆與表達(dá)分析

符爽1，2，孫開來1，富偉能1

（中國醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)教研室，沈陽110001；2.附屬盛京醫(yī)院血液研究室，沈陽110022）

目的確定MYCT1基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)并克隆該基因新的轉(zhuǎn)錄本，探討該基因的結(jié)構(gòu)和功能。方法利用已知MYCT1的保守序列，應(yīng)用5′-RACE技術(shù)確定轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)位置，結(jié)合3′-RACE拼接得到新轉(zhuǎn)錄本的精確全長；然后利用生物信息學(xué)軟件對新轉(zhuǎn)錄本與MYCT1的cDNA序列及氨基酸序列進(jìn)行對比分析；最后利用RT-PCR的方法分析新轉(zhuǎn)錄本的細(xì)胞表達(dá)譜。結(jié)果成功克隆得到長1 106 bp的新轉(zhuǎn)錄本MYCT1-TV，其轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)位于ATG上游140 bp處。MYCT1-TV與MYCT1在結(jié)構(gòu)上無明顯差異，并廣泛表達(dá)于各個(gè)細(xì)胞系。結(jié)論MYCT1轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的確定和新轉(zhuǎn)錄本MYCT1-TV的克隆，為進(jìn)一步研究MYCT1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制及基因功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

MYCT1；MYCT1-TV；喉癌；RACE

MYCT1（Myc target 1）是本研究室前期應(yīng)用實(shí)體瘤培養(yǎng)、常規(guī)G顯帶、FISH及電子雜交的方法從喉鱗狀細(xì)胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC，以下簡稱喉癌）中克隆得到的新基因，曾命名MTLC（c-Myc target from laryngeal cancer cells），Gen-Bank登錄號為AF_527367［1］。

MYCT1基因定位于染色體6q25，全長約21 kb，含2個(gè)外顯子，其mRNA序列長約1 006 bp，編碼含235個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。本研究組在前期研究中通過生物信息學(xué)方法，預(yù)測該基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)位于ATG上游47 bp處［1］，但未經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。進(jìn)一步研究MYCT1基因的結(jié)構(gòu)并確定其轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，對了解該基因的功能和闡明其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制具有重要意義。本研究利用已知MYCT1的保守序列，以正常人外周血RNA為模板，應(yīng)用5′-RACE（5′-rapid amplification of cDNA ends）的方法確定了MYCT1的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，并結(jié)合3′-RACE克隆得到MYCT1新的轉(zhuǎn)錄本，通過生物信息學(xué)的方法對比分析2個(gè)轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)，并檢測新轉(zhuǎn)錄本在不同細(xì)胞系中的表達(dá)情況，為明確MYCT1的結(jié)構(gòu)和功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

細(xì)胞系：人喉癌Hep2細(xì)胞、人胚腎HEK293細(xì)胞、人肝癌Bel7402細(xì)胞、人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人高分化胃癌BGC823細(xì)胞、人中分化胃癌SGC7901細(xì)胞、人低分化胃癌MKN1細(xì)胞、人胃黏膜上皮GES1細(xì)胞（購自中科院上海細(xì)胞庫）。

主要試劑：反轉(zhuǎn)錄試劑盒、膠回收試劑盒、pMD18-T載體、JM109感受態(tài)細(xì)胞及PCR相關(guān)試劑購自TaKaRa公司，全血RNA提取試劑盒購自Galen Biopharm公司，無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒購自Tiangen公司，SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit購自Clontech公司。

培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基（自配），其中胰蛋白胨和酵母提取物為Sigma公司產(chǎn)品，RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 全血RNA的提取及RNA質(zhì)量的鑒定：取2 mL正常人新鮮抗凝血加入6 mL紅細(xì)胞裂解液1× RLB，顛倒混勻。室溫放置10 min，期間可輕彈顛倒混勻。離心后棄紅色上清，留下完整白細(xì)胞團(tuán)在管底。按Galen Biopharm公司試劑盒說明書步驟進(jìn)行全血RNA的提取。將電泳槽沖洗干燥后用0.1% DEPC處理水浸泡過夜，取2 μL加樣緩沖液與3 μL RNA溶液混勻后于l%的瓊脂糖凝膠電泳，4℃冰箱中130 V電泳27 min。

1.2.2MYCT1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的確定及新轉(zhuǎn)錄本的克?。阂訫YCT1的保守序列為模板，按照RACE試劑盒說明書要求設(shè)計(jì)模板特異性引物（GSP）和巢式PCR引物（NGSP）。引物序列如下：GSP1：5′-CATAGGCAGGTGGGGGCGGTGTT-3′；GSP2：5′-TATCCATGGCAATCGGGCTGGTACT-3′；NGSP1：5′-TGGACCAGTAGTCAGGACGGCTCAGA-3′；NGSP2：5′-AGTGGCTGTGAACGTCGAAGCAACC-3′。然后分別進(jìn)行5′-和3′-RACE擴(kuò)增，分別以設(shè)計(jì)的GSP1、GSP2為5′-RACE和3′-RACE的特異引物，與UPM（試劑盒自帶）進(jìn)行cDNA 5′端和3′端的一次擴(kuò)增，然后分別以NGSP1、NGSP2為巢式PCR的特異引物，與NUP（試劑盒自帶）進(jìn)行cDNA 5′端和3′端的二次擴(kuò)增。分別將5′端和3′端的擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后，克隆至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆送南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3 RT-PCR驗(yàn)證RACE結(jié)果：為了排除RACE受基因組污染的可能性，采用RT-PCR的方法對RACE結(jié)果的真實(shí)性進(jìn)行驗(yàn)證。設(shè)計(jì)上下游引物擴(kuò)增拼接后得到的cDNA全長，以5′-RACE cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如下：Forward，5′-GAACAC AAGTATATGAGGGGTTG-3′；Reverse，5′-AGTCAC ATTGGAAGTAAATGAGGATTG-3′，反應(yīng)體系與說明書一致。

PCR反應(yīng)條件為：95℃4 min→（95℃30 s、60℃15 s、72℃2 min20 s）×35 cycles→72℃7 min→4℃∞。將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后，挑取陽性克隆送南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測MYCT1新轉(zhuǎn)錄本在各細(xì)胞系中的表達(dá)水平：分別收集5×106個(gè)Bel7402、Hep2、HeLa、BGC823、SGC7901、MKN1、GES1和HEK293細(xì)胞，用Trizol方法提取細(xì)胞總RNA，按照試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以上述提取的各細(xì)胞系的總cDNA為模板，以正常人外周血中MYCT1-TV的mRNA表達(dá)水平作為陽性對照，通過PCR的方法檢測MYCT1-TV在各細(xì)胞系的表達(dá)水平。MYCT1-TV引物序列：Forward，5′-TAATAACACAACAAGTTTA GGGAGT-3′；Reverse，5′-AGTCACATTGGAAGTAA ATGAGGATTG-3′，產(chǎn)物大小為929 bp。β-actin引物序列：Forward，5′-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3′；Reverse，5′-CACCTTCACCGTTCCAGT TT-3′，產(chǎn)物大小為511 bp。

2 結(jié)果

2.1MYCT1新轉(zhuǎn)錄本的獲得及結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 總RNA的鑒定結(jié)果：從外周血提取的總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳可見28 S、18 S和5.8 S rRNA 3條清晰的帶（圖1），OD260/OD280的比值約為1.90，濃度約為0.2 g/L，表明抽提的RNA質(zhì)量較好，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 RNA完整性電泳圖Fig.1 Agar electrophoresis of RNA integrity

2.1.2 5′/3′-RACE巢式PCR檢測結(jié)果：5′端經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增得到長約690 bp和1 400 bp的2個(gè)DNA片段，3′端經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增得到長約750 bp、1 200 bp、1 800 bp、2 500 bp和3 000 bp的5個(gè)DNA片段（圖2）。

圖2 巢式PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果Fig.2 Result from electrophoresis detection of nested PCR products

2.1.3MYCT1全長cDNA的拼接及轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的鑒定結(jié)果：將巢式得到的7個(gè)片段經(jīng)過連接轉(zhuǎn)化后送測序鑒定。根據(jù)測序結(jié)果，我們將5′序列和3′序列進(jìn)行了拼接，并與Blast進(jìn)行比對，結(jié)果得到1個(gè)全長為1 106 bp的MYCT1新的轉(zhuǎn)錄本（圖3），命名為MYCT1-TV（myc target 1 transcript variant 1），并提交GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得GenBank登錄號GU997693，并確定此轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)為cDNA的第一個(gè)堿基“G”。

圖3 拼接后的MYCT1?TV cDNA序列Fig.3 MYCT1?TV cDNA sequence after splicing

2.1.4 拼接后MYCT1-TVcDNA序列鑒定結(jié)果：參照我們所設(shè)計(jì)的PCR引物，RT-PCR產(chǎn)物大小理論上應(yīng)為1 074 bp（除去polyA尾長度）。經(jīng)RT-PCR檢測，我們獲得大小為1 000 bp左右的單一條帶（圖4），與預(yù)期相符，將產(chǎn)物膠回收后克隆至pMD18-T載體，連接、轉(zhuǎn)化后，篩選陽性質(zhì)粒送測序，提取插入序列進(jìn)行Blast分析，顯示克隆的片段確系MYCT1-TV的cDNA序列。

圖4 RT?PCR拼接后MYCT1?TV cDNA電泳圖Fig.4 Agar electrophoresis of MYCT1?TV cDNA after splicing by RT?PCR

2.1.5MYCT1-TV與MYCT1序列的比較分析：應(yīng)用ExPASy proteomics server軟件，我們對MYCT1-TV的cDNA序列進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖5所示：MYCT1-TVcDNA全長1 106 bp，編碼包含187個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，蛋白分子量為20 835 Da，等電點(diǎn)為10.26，5′UTR長140 bp，3′UTR長370 bp，polyA尾長32 bp，其轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)位于MYCT1-TV的翻譯起始點(diǎn)ATG上游140 bp處（圖6A）。Blast分析結(jié)果顯示：MYCT1-TV-cDNA 5′旁側(cè)序列比MYCT1短，3′旁側(cè)序列比MYCT1長（圖6A）；蛋白質(zhì)序列的比較分析發(fā)現(xiàn)，MYCT1-TV編碼的氨基酸序列除了比MYCT1少48個(gè)氨基酸序列外，其余187個(gè)氨基酸序列與后者完全一致（圖6B），且經(jīng)ExPASy proteomics server的分析結(jié)果顯示，減少的這48個(gè)氨基酸無明顯的結(jié)構(gòu)域和功能域。

圖5 MYCT1?TV cDNA序列特征Fig.5 cDNA characteristics of MYCT1?TV

2.2MYCT1-TV在各細(xì)胞系中表達(dá)水平的檢測結(jié)果

RT-PCR結(jié)果顯示：MYCT1-TVmRNA在各細(xì)胞系中均有表達(dá)，在GES1和HEK293等正常細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著高于Hep2、HeLa、BGC823、SGC7901、Bel7402和MKN1等癌細(xì)胞系（P＜0.01，圖7），MYCT1-TVmRNA在GES1和HEK293細(xì)胞系的表達(dá)水平與正常人外周血細(xì)胞相比無顯著差異（P＞0.05，圖7），且在各腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)也無顯著差異（P＞0.05，圖7）。

圖6 MYCT1?TV和MYCT1的序列比較Fig.6 Comparison of MYCT1?TV and MYCT1sequences

圖7 MYCT1?TV在人各細(xì)胞系中mRNA的表達(dá)水平Fig.7 MYCT1?TV mRNA levels in different human cell lines

3 討論

RACE是基于PCR技術(shù)，由已知的部分cDNA序列來獲得完整cDNA序列的一種方法，為Frohman在1985年首次報(bào)道［2］。該技術(shù)的出現(xiàn)解決了PCR擴(kuò)增效率低和特異性差，不易得到完整的全長基因的問題。它可以從低豐度的轉(zhuǎn)錄本中快速擴(kuò)增cDNA的 5′和3′末端。近年來對RACE技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)［3～5］，SMART-RACE技術(shù)就是其中最經(jīng)典、應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一［6～10］。SMART技術(shù)最大限度地提高了在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中獲取全長cDNA的可能，只需一種引物和基因特異引物配對即可擴(kuò)增出5′和3′RACE產(chǎn)物，而且只需cDNA第一鏈為模板，無需進(jìn)行cDNA第二鏈的合成，也無需接頭的連接。對于只有少量起始材料的RNA，SMART-RACE也可以通過應(yīng)用長距離PCR的方法，利用含poly（A）的RNA或總RNA甚至低豐度的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為起始材料來克隆全長cDNA［11］，已成為目前公認(rèn)的確定基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)、克隆基因cDNA精確全長的經(jīng)典方法。

本研究利用GenBank數(shù)據(jù)庫中MYCT1的保守序列，通過SMART-RACE方法，從正常人外周血RNA中克隆獲得長1 106 bp的MYCT1的新的轉(zhuǎn)錄本MYCT1-TV，并精確定位了該基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)位于MYCT1-TV基因ATG上游140 bp處。MYCT1-TV具有完整的開放閱讀框，且3′端有poly（A）加尾。開放閱讀框分析表明，該轉(zhuǎn)錄本編碼含187個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。氨基酸序列的比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MYCT1-TV編碼的187個(gè)氨基酸完全是MYCT1編碼的235個(gè)氨基酸的一部分，且少的這48個(gè)氨基酸無明顯的結(jié)構(gòu)域和功能域。表明2個(gè)轉(zhuǎn)錄本在結(jié)構(gòu)上無明顯差異，但它們在功能上是否存在差異有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

基因表達(dá)譜分析表明，MYCT1-TV在各個(gè)細(xì)胞系中均有表達(dá)，表明MYCT1-TV基因并不是喉部組織特異性基因，在其他組織細(xì)胞中也有表達(dá)，該基因可能對維持細(xì)胞的正常生理功能是必需的。另外，MYCT1-TV在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著低于其在正常細(xì)胞系中的表達(dá)水平，這與MYCT1在喉癌［12］、胃癌［13］和乳腺癌［14］等腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)的結(jié)果一致，表明其可能同樣發(fā)揮腫瘤抑制基因功能。

總之，MYCT1-TV基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的確定和cDNA全長的克隆為研究該基因啟動子區(qū)的調(diào)控和基因功能奠定了基礎(chǔ)。

［1］邱廣斌，邱廣蓉，徐振明，等.6q25區(qū)域內(nèi)一個(gè)新基因MTLC的克隆及特性分析［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2003，20（2）：94-97.

［2］徐燁，劉雅婷，代文瓊，等.幾種主要的RACE技術(shù)及應(yīng)用［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2012，14（2）：81-87.

［3］Yeku O，F(xiàn)rohman MA.Rapid amplification of cDNA ends（RACE）［J］.Methods Mol Biol，2011，703：107-122.

［4］Dallmeier K，Neyts J.Simple and inexpensive three-step rapid amplification of cDNA 5′ends using 5′phosphorylated primers［J］. Anal Biochem，2013，434（1）：1-3.

［5］Bower NI，Johnston IA.Targeted rapid amplification of cDNA ends（T-RACE）-an improved RACE reaction through degradation of nontarget sequences［J］.Nucleic Acids Res，2010，38（21）：e194.

［6］Li G，Luo H，Sun G，et al.Cloning and characterization of a novel apolipoprotein gene，apolipoprotein AV，in tree shrews［J］.Mol Biol Rep，2013，40（9）：5429-5438.

［7］Rampias TN，F(xiàn)ragoulis EG，Sideris DC.Efficient cloning of alternatively polyadenylated transcripts via hybridization capture PCR［J］. Curr Issues Mol Biol，2012，14（1）：1-8.

［8］Zeng LG，Wang JH，Li YJ，et al.Molecular characteristics and expression of calmodulin cDNA from the freshwater pearl mussel，Hyriopsis schlegelii［J］.Genet Mol Res，2012，11（1）：42-52.

［9］Sun G，Li M，Li H，et al.Molecular cloning and SNP association analysis of chicken PMCH gene［J］.Mol Biol Rep，2013，40（8）：5049-5055.

［10］Cheng H，Kong W，Hou D，et al.Isolation，characterization，and expression analysis of CmMLO2 in muskmelon［J］.Mol Biol Rep，2013，40（3）：2609-2615.

［11］Tabansky I，Nurminsky DI.Mapping of transcription start sites by direct sequencing of SMART RACE products［J］.Biotechniques，2009，34（3）：482，485-486.

［12］Qiu GB，Hao DM，Gong LG，et al.MTLC gene was down-regulated in laryngeal cancer tissues and could promote apoptosis of Hep2 cells［J］.Chin J Lab Med，2005，28（11）：1178-1180.

［13］Qiu GB，Gong LG，Hao DM，et al.Expression of MTLC gene in gastric carcinoma［J］.World J Gastroenterol，2009，9（10）：2160-2163.

［14］歐陽小明，黃世章，梅開勇.MTLC基因在乳腺癌組織中的表達(dá)及其意義［J］.中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2006，9（7）：695-696.

（編輯 王又冬）

Cloning and Expression Analysisofa Novel MYCT1Transcript

FUShuang1，2，SUNKai-lai1，F(xiàn)UWei-neng1
（1.DepartmentofMedicalGenetics，College ofBasic MedicalScience，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China；2.DepartmentofHematology Laboratory，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110022，China）

ObjectiveTo identify the transcriptional start site and clone a novel transcript variant ofMYCT1（Myc target 1）for further study of its structure and function.MethodsTranscriptional start site was confirmed usingMYCT1conserved sequence by 5′-RACE method and a novelMYCT1isoform was cloned by splicing with 3′-RACE PCR product.Then，the cDNA or amino acid sequence betweenMYCT1and its isoform was compared using bioinformatics server.Finally，the expression profile of this novel transcript in different cell lines was detected through RT-PCR.Re?sultsA 1 106 bp transcript named MYCT1-TV（Myc target 1 transcript variant 1）was successfully cloned，and its transcriptional start site was confirmed which located at 140 bp upstream of the ATG start codon of MYCT1-TV.MYCT1-TV shows no obviously structural difference withMYCT1and is widely expressed in various cell lines.ConclusionThe transcriptional start site analysis and MYCT1-TV cloning provide an experimentalbasisforthe furtherexploration and understanding ofthe function and the transcriptionalregulation mechanism ofMYCT1.

MYCT1；MYCT1-TV；laryngeal squamous cell carcinoma；RACE

R394.3

A

0258-4646（2014）05-0388-05

國家自然科學(xué)基金（81372876）；國家自然科學(xué)基金青年基金（81300420）

符爽（1983-），女，助理研究員，博士.

富偉能，E-mail：wnfu@mail.cmu.edu.cn

2014-01-06

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：