乳苣水提取物誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞H1299和A549的凋亡

張彩艷,劉小敏,華子義,賀燕云

(上海大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,上海 200444)

據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì),全世界每年有1000萬新發(fā)癌癥患者,600萬人死于癌癥,癌癥幾乎是死亡的代名詞.目前,治療癌癥的措施有手術(shù)、化療、放療和免疫治療等方法,但其治療效果都不理想.由于中藥的毒副作用低,能提高機(jī)體的免疫力,所以越來越多的中晚期癌癥患者選擇中藥治療,許多報(bào)道也證明了中藥在抗腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移中的優(yōu)勢(shì).因此尋找能預(yù)防癌癥并能長期服用的高效無毒的中草藥成為迫切的問題.

藥食兩用植物乳苣(Mulgediumtataricum(Linn.) DC.)為菊科乳苣屬植物,又名蒙山萵苣、紫花山萵苣、苦菜等,多年生草本植物,民間作為野菜采食,有抗菌、消炎、止痛等功效.已有的對(duì)乳苣的研究主要集中在對(duì)乳苣的總黃酮和多酚的提取和抗氧化方面的研究[1-4].天然的黃酮類化合物具有抗心腦血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、治療骨質(zhì)疏松,它具有清除自由基、超氧化物和羥基自由基、抑制脂質(zhì)過氧化及抗癌、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗輻射等作用[5-6].王小雄等從乳苣全草中分離到41種化合物,其中3種物質(zhì)萵苣素-8-O-對(duì)甲氧基苯乙酸酯、萵苣素、山萵苣素被實(shí)驗(yàn)證明能夠抑制體外培養(yǎng)的人的白血病細(xì)胞(HL-60)和人肝癌細(xì)胞(SMMC-7721)的生長[7-8].本文作者想要驗(yàn)證乳苣作為中草藥對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用,所以直接用沸水浸泡乳苣所得的水提取物作用于體外培養(yǎng)的人肺癌細(xì)胞株H1299和A549,探討乳苣的水提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長抑制及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用,為保健品和新藥的研究開發(fā)提供線索.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株

人肺癌細(xì)胞株H1299和A549;購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究院.

1.1.2 主要試劑

乳苣(Mulgediumtataricum(Linn.) DC.)為菊科乳苣屬植物,采于晉西北農(nóng)田,由上海大學(xué)生命學(xué)院王偉博士鑒定.RPMI-1640培養(yǎng)基(CORNING);胎牛血清(Hyclone);胰蛋白酶(Hyclone);Penicillin-Streptomycin Solution(Hyclone);CCK-8試劑盒(上海七海復(fù)泰生物公司);Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海七海復(fù)泰生物公司);線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(Jc-1)(碧云天生物公司).

1.1.3 主要儀器

流式細(xì)胞儀為Moflow XDP;CO2培養(yǎng)箱;酶標(biāo)儀為美國BioRad產(chǎn)品;倒置顯微鏡為LEICA 公司產(chǎn)品;冷凍干燥機(jī)為美國LABCONCO公司產(chǎn)品.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳苣水提取物制備

采全草,陰干,-80 ℃保存.將8 g的干乳苣,粉碎,浸泡到100 mL沸水中,超聲1 h,沸水浴30 min,過濾2次,分裝原液經(jīng)48 h冷凍干燥后制成凍干粉,-80℃保存,備用.使用時(shí),用培養(yǎng)基重新溶解凍干粉,0.22 μm濾膜過濾后使用.

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

以含10%新生牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)H1299和A549,37 ℃、5 % CO2,恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)消化傳代.

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)觀察

細(xì)胞均勻鋪在24孔板中,待細(xì)胞貼壁生長至覆蓋培養(yǎng)板底部50%～60%時(shí),用不同濃度乳苣水提取物處理細(xì)胞48 h,另設(shè)不加藥的空白對(duì)照,每個(gè)劑量設(shè)3個(gè)重復(fù),在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài).

1.2.4 細(xì)胞增殖活力檢測(cè)(CCK-8法)

將細(xì)胞均勻鋪于96孔板中,待細(xì)胞貼壁生長至覆蓋培養(yǎng)板底部50%～60%時(shí),用不同濃度乳苣水提取物處理細(xì)胞48 h,檢測(cè)前4 h先換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),每孔加5 μL CCK-8溶液,避光溫育1～2 h,用酶標(biāo)儀測(cè)450 nm下的吸光值,每個(gè)劑量重復(fù)4次,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.5 Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

不同濃度乳苣水提取物處理細(xì)胞48 h后收集到的細(xì)胞,取200 μL loading buffer懸浮細(xì)胞,2.5 μL FITC染色,室溫避光處理15 min,再用5 μL PI染色,冰浴避光處理5 min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè),用Summit 5.2 獲取數(shù)據(jù)并分析.

1.2.6 細(xì)胞膜電位的檢測(cè)

不同濃度乳苣水提取物處理細(xì)胞48 h后收集到的細(xì)胞,加入Jc-1染色工作液后,避光溫育20 min.染色完成后,用1 mL Jc-1(5X)與4 mL超純水比例配制的Jc-1(1X)洗滌緩沖液(冰浴)洗滌2遍后流式細(xì)胞儀檢測(cè),用試劑盒提供的CCCP作為誘導(dǎo)線粒體膜電位下降的陽性對(duì)照.用FL1(FITC)和FL2(RPE-TR)通道接收信號(hào).

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié) 果

2.1 乳苣水提取物對(duì)H1299和A549細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖1所示,不同濃度乳苣水提取物分別作用H1299和A549細(xì)胞48 h后,光鏡下直接可見未給藥對(duì)照組細(xì)胞貼壁狀況良好,細(xì)胞透明,折光性好;濃度達(dá)到1.2 mg/mL的處理組密度明顯降低,細(xì)胞貼壁能力減弱,細(xì)胞皺縮,出現(xiàn)了明顯的凋亡形態(tài)學(xué)特征.

圖1 不同濃度乳苣水提取物對(duì)H1299和A549細(xì)胞生長的影響 (A:H1299; B:A549)

2.2 乳苣的水提取物明顯抑制了H1299和A549細(xì)胞的增殖

如圖2所示,乳苣水提取物作用H1299和A549細(xì)胞48 h后,對(duì)細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用.乳苣對(duì)H1299增殖的抑制作用與其劑量、作用時(shí)間呈正相關(guān),實(shí)驗(yàn)組的增殖抑制作用與空白對(duì)照組比較,均有顯著性差異(P<0.05).對(duì)于A549細(xì)胞,處理濃度達(dá)到1.2 mg/mL時(shí),細(xì)胞的增殖抑制程度與空白對(duì)照組比較,有顯著性差異(P<0.05).

2.3 乳苣水提取物誘導(dǎo)H1299和A549細(xì)胞的凋亡

在細(xì)胞凋亡的早期階段,胞漿膜磷脂的不對(duì)稱性喪失,導(dǎo)致膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸(PS)從細(xì)胞膜內(nèi)層暴露于外層,從而可被PS特異的AnnexinV探針?biāo)鶚?biāo)記,PI不能透過完整的細(xì)胞膜,但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞,PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染.因此將Annexin-V與PI匹配使用,就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來.流式AnnexinV-FITC/PI雙參數(shù)圖(圖3,4)可見,右下象限(FITC+/PI-)和右上象限(FITC+/PI+)分別代表細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡,左下象限為活細(xì)胞(FITC-/PI-),左上象限為壞死細(xì)胞(FITC-/PI+).不同劑量的乳苣水提取物作用H1299細(xì)胞的平均凋亡率分別為10.5%、13.36%、15.36%、21.2%、36.01%、96%,作用A549細(xì)胞的平均凋亡率分別為8.31%,7.33%,15.56%,44.2%,46.82%,當(dāng)處理濃度達(dá)到1.2 mg/mL,作用48 h后,處理組凋亡率與對(duì)照組相比均有顯著性意義(P<0.05).

圖2 不同濃度乳苣的水提取物對(duì)H1299和A549細(xì)胞增殖的影響

圖3 不同濃度乳苣的水提取物作用H1299細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

圖4 不同濃度乳苣的水提取物作用A549細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

2.4 乳苣水提取物處理H1299和A549細(xì)胞后細(xì)胞膜電位下降

線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡的一個(gè)標(biāo)志性事件[9].在線粒體膜電位較高時(shí),探針JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中,形成聚合物,產(chǎn)生紅色熒光;在線粒體膜電位較低時(shí),JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中,此時(shí)JC-1為單體,產(chǎn)生綠色熒光.因此可通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測(cè)線粒體膜電位的變化.如圖5所示活細(xì)胞線粒體膜電位高,線粒體內(nèi)JC-1聚合物的濃度高,紅色熒光很強(qiáng),在流式圖上表現(xiàn)為雙陽性,而凋亡細(xì)胞則大多為FITC單陽性.用帶紅色熒光信號(hào)的細(xì)胞比例的下降來表示線粒體去極化程度,乳苣水提取物處理H1299和A549 48 h后,經(jīng)JC-1染色,雙陽性細(xì)胞隨著藥物濃度的增加逐漸減少,表明乳苣水提取物處理細(xì)胞后,細(xì)胞的膜電位明顯下降,結(jié)合前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乳苣確實(shí)能誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞H1299和A549凋亡.

圖5 不同濃度乳苣水提取物作用H1299和A549細(xì)胞膜電位的變化 (A:H1299; B:A549)

3 討 論

近年我國各類癌癥發(fā)病率日益上升,迫切需要找出既能抑制癌細(xì)胞增殖又對(duì)人體危害較少的藥物,因此開發(fā)天然抗癌藥物成為研究熱點(diǎn).本研究中的菊科乳苣屬植物乳苣(Mulgediumtataricum(Linn.) DC.)為藥食兩用野生植物,我國晉西北人長期采食,以其特有的苦寒屬性及所含成份,煮熟放置后長期不餿、食后具有泄熱寧神、清心明目、消炎解毒作用.由于苦菜的食用方法多為沸水煮食或陰干后泡食,所以實(shí)驗(yàn)材料用陰干的乳苣全草的水浸泡提取物作用于癌細(xì)胞,以此探索乳苣水溶狀態(tài)下對(duì)癌細(xì)胞的作用.這樣的研究為開發(fā)乳苣這種食用野菜,尋找預(yù)防和治療癌癥的新藥物提供理論基礎(chǔ).

圖6 不同濃度乳苣水提取物作用H1299和A549細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)活性氧水平檢測(cè) (A:H1299; B:A549)

本實(shí)驗(yàn)觀察了乳苣水提取物對(duì)體外培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞H1299和A549生長、增殖、凋亡的影響.雖然低濃度劑量組(0.4 mg/mL)在細(xì)胞形態(tài)和增殖活力檢測(cè)的結(jié)果中與對(duì)照組相比差異不是很明顯,但是流式的檢測(cè)結(jié)果表明,當(dāng)濃度低至0.4 mg/mL時(shí),乳苣水提取物作用48 h對(duì)H1299細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡的作用,但當(dāng)濃度達(dá)到1.2 mg/mL時(shí)才能明顯地誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡.本實(shí)驗(yàn)中同時(shí)觀察了另外一種十字花科蕓薹屬蔬菜青菜對(duì)這兩株細(xì)胞生長的影響,用同樣方法處理材料,高濃度(2 mg/mL)的青菜水提取物處理肺癌細(xì)胞H1299和A549 48 h后卻能很明顯地促進(jìn)細(xì)胞的生長(結(jié)果未顯示).由于乳苣這種食用植物中同樣也含有有利于細(xì)胞生長的營養(yǎng)成分,低濃度時(shí)促進(jìn)細(xì)胞生長,但高劑量的乳苣提取物,抑癌活性物質(zhì)的濃度也會(huì)增加,這些活性物質(zhì)誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡,而青菜中并不含有抑制肺癌細(xì)胞生長的活性物質(zhì),所以較高濃度下并不能誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,說明乳苣這種食用野菜中確實(shí)含有能抑制癌細(xì)胞生長的活性物質(zhì).

所有數(shù)據(jù)表明乳苣水提取物可以明顯地抑制體外培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞H1299和A549的增殖,而這種抑制作用可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的,藥物處理后細(xì)胞膜電位的下降說明這種凋亡可能是線粒體凋亡途徑介導(dǎo)的.后期將對(duì)乳苣水提取物誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞H1299和A549凋亡的機(jī)制和對(duì)體內(nèi)生長的細(xì)胞的影響做進(jìn)一步研究,這對(duì)臨床應(yīng)用將有十分重要的指導(dǎo)意義.

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