硫氧還蛋白f介導(dǎo)的煙草Rubisco活化酶的氧化還原調(diào)控

孫 逸，陳 娟，馬為民，陳根云，米華玲

(1. 上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234；2. 中國科學(xué)院 上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所，上海 200032)

0 引 言

Wildman和Bonner 于1947年發(fā)現(xiàn)了核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco),它普遍存在于所有自養(yǎng)生物中.Rubisco位于高等植物葉綠體的基質(zhì)內(nèi),在基粒片層區(qū)域有少量的分布[1-2].在植物體內(nèi)并不是所有的Rubisco都具有催化活力,它的光活化需要Rubisco活化酶(Rubisco activase,RCA)來參與[3-4].

RCA是一種核編碼的有6個亞基組成的可溶性蛋白[5],植物RCA只在綠色組織中表達(dá).它通常由α(較大)、β(較小)兩種亞型組成,亞型的種類及其含量因植物種類不同而有很大變化,如在擬南芥、菠菜、大麥、水稻、棉花和小麥等植物中,RCA含有兩種亞型,而在煙草、玉米和衣藻中僅含有一種小亞型.RCA的兩個亞型通常是由一個核基因編碼的,通過選擇性剪接前體mRNA形成,并且兩個亞型只在羧基端有差異.但是棉花的RCA的兩個亞型是由兩個核基因編碼的[6].大麥RCA的兩個亞型可以由一個核基因編碼,但其小亞型還可以被另一個基因編碼[7].RCA的兩個亞型都具有活化Rubisco的活性,但只有大亞型RCA的氧化還原狀態(tài)通過硫氧還蛋白f(Trx-f)的介導(dǎo)受體內(nèi)氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié),從而引起其活力的變化[8].

硫氧還蛋白(Thioredoxin,Trx)是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的多功能酸性蛋白,分子量約12 kDa左右,參與細(xì)胞一系列生化反應(yīng),包括酶活性的調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控等[9-12],是酶活力的一個重要調(diào)節(jié)蛋白.其功能絕大多數(shù)依賴于Trx對靶蛋白中的二硫鍵還原.所有硫氧還蛋白均有一個保守的活性中心:rp-Cys-Gly(Ala)-Pro-Cys,活性中心有2個具有氧還活性的半胱氨酸殘基.相鄰的兩個半胱氨酸可以在分子內(nèi)部形成二硫鍵.按電子供體和還原Trx的酶,植物Trx可分為兩個系統(tǒng):即鐵氧還蛋白/ 鐵硫蛋白還原酶/ 硫氧還蛋白系統(tǒng) (FTR/ Trx系統(tǒng)) 和NADPH/ NADP+/硫氧還蛋白還原酶/ 硫氧還蛋白系統(tǒng)(NTR/ Trx系統(tǒng)).其中FTR/ Trx系統(tǒng)位于葉綠體中,由鐵氧還蛋白(Ferredoxin)、鐵硫蛋白還原酶(FTR)和兩個由核編碼的Trx-m和Trx-f組成,調(diào)控參與碳代謝等生化過程一些酶的活性,比如RCA[13-14].Zhang 和Portis 等認(rèn)為RCA的氧化還原狀態(tài)的改變是體內(nèi)的氧化還原物質(zhì),如GSH,GSSG等,通過Trx-f介導(dǎo)首先改變大亞型的氧化還原狀態(tài)[15],然后大亞型RCA可能通過多聚體的各亞型間的相互作用來改變小亞型的活性[8].其中擬南芥的大亞型C-末端的兩個Cys殘基在受Trx-f的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用,C-末端的一個或兩個Cys殘基用丙氨酸取代,則轉(zhuǎn)基因植物中的Rubisco的活性不會因光強(qiáng)變?nèi)醵抡{(diào),而小亞型RCA缺乏這一含Cys殘基的C-末端.但很多植物,如煙草等,只有小亞型RCA,缺乏大亞型末端的半胱氨酸,因此Zhang 和Portis 等認(rèn)為體內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變不能影響只有小亞型的RCA的活力,但他們也指出以往大量實驗證據(jù)證明煙草等只有小亞型RCA物種的Rubisco活力在不同光強(qiáng)下其活力有明顯的差異,表明這些物種的Rubisco活力也是受光引起的葉綠體內(nèi)氧化還原狀態(tài)的調(diào)控,因此人們一直在探索煙草等植物體內(nèi)氧化還原狀態(tài)變化影響Rubisco活力的機(jī)制,然迄今沒有任何相關(guān)新的研究報道.

通過在菠菜和煙草Trx-f存在條件下,不同氧化還原狀態(tài)處理雙亞型和單亞型RCA后其活化Rubisco活力的體外測定,本文作者發(fā)現(xiàn)通過Trx-f介導(dǎo)也能改變單亞型RCA的氧化還原狀態(tài),從而影響其活力,而且Trx-f介導(dǎo)的RCA氧化還原的調(diào)控存在明顯的種屬差異性.這對RCA活力的氧化還原調(diào)控研究提供了新的思路.

1 實驗材料與方法

1.1 植物材料

煙草(Nicotianatabacum)、菠菜(SpinaciaoleraceaL)、番茄(Solanumlycopersicum)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)種植于中國科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所人工氣候室.培養(yǎng)條件為:28/20℃,光通量電子密度(PPFD)約600 μmol·m-2·s-1,12 h光/12 h暗.煙草ΔndhCKJ突變體由T.shikanai博士提供[16].

1.2 煙草與菠菜Trx-f的分離純化

煙草與菠菜Trx-f的分離純化參照Wolosiuk等的方法進(jìn)行[17].得到的Trx-f保存于65%硫酸銨沉淀懸浮液中.

1.3 Rubisco的初始活力測定

參考Van de Loo等的方法[18],光下取得的葉圓片分別置于培養(yǎng)皿,將培養(yǎng)皿置與0～500 μmol·m-2·s-15個不同光強(qiáng)下處理60 min.處理結(jié)束后葉圓片用液氮速凍.將樣品在液氮中快速研磨成粉末.加入預(yù)冷到4 ℃ 400 μL蛋白提取液(50 mmol·L-1Tris-Cl,pH 8.0,50 mmol·L-1NaCl,2 mmol·L-1EDTA,4 mmol·L-1巰基乙醇),充分研磨.13000 r·min-1,4 ℃ 離心2 min,收集上清液,馬上用于活力測定,并用Bradford法進(jìn)行蛋白定量[19].

預(yù)先配制Rubisco活力測定的反應(yīng)體系.如下:50 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.2,10 mmol·L-1MgCl2,10 mmol·L-1NaHCO3,0.4 mmol·L-1RuBP ,0.1 mmol·L-1EDTA.最后加入適量的(1∶100) NaH14CO3.

1.4 煙草、擬南芥、菠菜、番茄葉片RCA的分離與純化

新鮮葉片馬上經(jīng)液氮速凍后磨碎,加入蛋白提取液(50 mmol·L-1Tris-HCl (pH 7.8),1 mmol·L-1EDTA,50 mmol·L-1NaCl,0.1% β-mercaptoethanol,1% PVPP(polyvinylpyrrolidone,SERVA),0.5 mmol·L-1phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF),protease inhibitor cocktail for plants (Sigma,P9599))混勻,提取物經(jīng)過離心后(10000 r·min-1/10 min)取上清,加入硫酸銨至終濃度為35%飽和度,12000 r·min-1離心10 min,去上清.沉淀用適量緩沖液(20 mmol·L-1Tris,pH 7.0,20 mmol·L-1NaCl,0.1% β-mercaptoethanol,1 mmol·L-1EDTA,0.4 mmol·L-1ATP,5 mmol·L-1phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF),protease inhibitor cocktail for plants (Sigma),溶解,離心(12000 r·min-1/5 min)后棄沉淀.蛋白純化在 Pharmacia FPLC system上完成,將脫鹽柱(Sephadex G-25)和弱陰離子交換柱 (DEAE-650) 串聯(lián).先用70 mmol·L-1NaCl,20 mmol·L-1Tris-HCl (pH 8.0) 洗脫雜蛋白,之后用150 mmol·L-1NaCl,20 mmol·L-1Tris-HCl (pH 8.0) 洗脫Rubisco 活化酶,分管收集,收集含RCA的部分,加入 protease inhibitor cocktail for plants (Sigma,P9599),0.1 mmol·L-1ATP和10%的甘油,保存在液氮中.

1.5 煙草、擬南芥、菠菜、番茄葉片Rubisco的分離和純化

新鮮葉片馬上經(jīng)液氮速凍后磨碎,加入蛋白提取液(50 mmol·L-1Tris-HCl (pH 7.8),1 mmol·L-1EDTA,50 mmol·L-1NaCl,0.1% β-mercaptoethanol,1% PVPP,0.5 mmol·L-1phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF))混勻,提取物經(jīng)過離心后(10000 g/10 min)取上清加入硫酸銨粉末至終濃度為35%飽和度,冰上放置0.5 h后離心(10000 r·min-1/10 min),取上清加入硫酸銨粉末至終濃度65%飽和度,冰上放置0.5 h后離心(10000 r·min-1/10 min).沉淀用適量緩沖液(20 mmol·L-1Tris,pH7.0,20 mmol·L-1NaCl,0.1% β-mercaptoethanol,1 mmol·L-1EDTA) 溶解,離心(12000 r·min-1/5 min).蛋白純化在 Pharmacia FPLC system上完成,將脫鹽柱(Sephadex G-25)和弱陰離子交換柱 (DEAE-650) 串聯(lián).先用100 mmol·L-1NaCl,20 mmol·L-1Tris-HCl (pH 8.0) 洗脫雜蛋白,之后用200 mmol·L-1NaCl,20 mmol·L-1Tris-HCl (pH 8.0) 洗脫Rubisco.蛋白濃度用Bradford法測定[19].

1.6 RCA的預(yù)處理及其活力的測定

RCA氧化還原處理及其活力的測定參照Zhang等方法進(jìn)行[14],用RCA活化Rubisco的活力代表RCA的活力.以未用DTT處理的對照為100%.

1.7 煙草葉片光系統(tǒng)II激發(fā)壓(1-qL)與凈光合速率的測定

煙草葉片光系統(tǒng)Ⅱ激發(fā)壓使用Maxi-imaging-PAM葉綠素?zé)晒鈨x(IMAGING-PAM chlorophyll fluorometer,Heinz Walz GmbH,Effeltrich,Germany)進(jìn)行測定.根據(jù)湖泊模型進(jìn)行計算,1-qL=1- (Fm′-F)/(Fm′-Fo′)xFo′/Fs[20].

凈光合速率測定用便攜式光合氣體分析系統(tǒng)Li-COR 6400(LI-COR Inc.Lincoln,Nebraska,U.S.A)光合儀進(jìn)行.測定方法參見Chen等[21],測定時CO2濃度控制在380 μmol CO2·mol-1.

圖1 不同光強(qiáng)處理對煙草Rubisco活力的影響橫坐標(biāo)所示數(shù)字是葉片處理光強(qiáng)(μmol·m-2·s-1)

1.8 統(tǒng)計分析

利用SigmaPlot 9.0(SPSS.Inc.)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,用雙尾studentt-test分析實驗樣本間的是否存在顯著性差異.

2 實驗結(jié)果

2.1 煙草Rubisco的初始活力受到氧化還原狀態(tài)的調(diào)控

植物體內(nèi)碳同化酶的活力普遍受到氧化還原狀態(tài)的調(diào)控,它們的活力對不同光強(qiáng)處理有明顯的響應(yīng)[15].將取自人工氣候室光下生長的煙草葉圓片分別在0、70、200、300和400 μmol/m2/s 光強(qiáng)下處理60 min后,提取可溶性蛋白進(jìn)行Rubisco初始活性測定.結(jié)果顯示(圖1),暗處理(光強(qiáng)為0)的煙草的Rubisco初始活力最低,大約為0.4 mmol·mg-1·min-1,隨著處理光強(qiáng)的增加,Rubisco初始活力迅速增加,當(dāng)光強(qiáng)達(dá)到300 μmol·m-2·s-1后,活力上升速率變緩,在光強(qiáng)為400 μmol·m-2·s-1時,Rubisco的初始活力最高,為0.9 mmol·g-1·min-1.處理光強(qiáng)與煙草Rubisco的初始活力存在明顯的正相關(guān),這與以往的許多研究結(jié)果一致.由于體內(nèi)Rubisco在ATP存在的條件下由RCA活化,由于Rubisco總量保持不變,其活力的變化反映了RCA的活力變化.在體外RCA的活力與ATP/ADP比值密切相關(guān),然而在正常的生理條件下其比值基本保持恒定[22],而不同光強(qiáng)下電子傳遞引起的氧化還原狀態(tài)則有明顯的改變[15].從上述結(jié)果可以推測煙草RCA與其他雙亞型RCA一樣,同樣受光引起的體內(nèi)氧化還原狀態(tài)的調(diào)控.

2.2 煙草突變體ΔndhCKJ體內(nèi)氧化還原狀態(tài)的改變導(dǎo)致其Rubisco活化狀態(tài)的改變

煙草ΔndhCKJ突變體為NDH復(fù)合體的ndhC、ndhK和ndhJ 3個亞基基因缺失突變體,與野生型的煙草相比,由于3個亞基的缺失,NDH蛋白復(fù)合體的全酶結(jié)構(gòu)破壞,其NDH復(fù)合體介導(dǎo)的循環(huán)電子傳遞能力缺失,導(dǎo)致植物體葉綠體內(nèi)氧化還原狀態(tài)發(fā)生改變.葉綠素?zé)晒鈪?shù)1-qL(光系統(tǒng)Ⅱ的激發(fā)壓)可以用來表示葉綠體類囊體膜氧化還原狀態(tài)的一個指標(biāo),光下煙草突變體葉片1-qL顯著高于野生型(圖2),并隨著照光時間的延長其差異越來越明顯.這說明野生型和突變體葉綠體內(nèi)的氧化還原狀態(tài)在光下有顯著的差異.同時,凈光合速率測定結(jié)果顯示突變體葉片的凈光合速率為14 μmol·m-2·s-1,顯著低于野生型的18 μmol·m-2·s-1(圖3).

圖2 煙草ΔndhCKJ突變體與野生型1-qL的比較

雙尾 student t-test,n=8.*表示5%的顯著水平.

Rubisco活力測定結(jié)果顯示(圖4),暗中野生型和突變體的Rubisco活化狀態(tài)沒有顯著性差異,分別為25%和24%;而光下野生型中68%的Rubsico是活化的,突變體中只有57%;它們的Rubisco活化狀態(tài)有顯著差異.突變體氧化還原狀態(tài)的改變伴隨著Rubisco活化狀態(tài)的改變進(jìn)一步說明了煙草Rubisco的活力也是受氧化還原狀態(tài)調(diào)控的.

2.3 不同氧化還原狀態(tài)下菠菜和煙草Trx-f對單亞型RCA活力的影響

Zhang等[8]利用擬南芥的Trx-f證明了雙亞型RCA通過大亞型RCA末端的巰基,感受體內(nèi)的氧化還原狀態(tài)信號,從而對RCA活力進(jìn)行調(diào)控;同時他們認(rèn)為只有小亞型的RCA不受氧化還原調(diào)控.然而前面的實驗結(jié)果表明煙草RCA與其他雙亞型RCA一樣,其活力同樣能受氧化還原狀態(tài)改變的影響,這里的矛盾是很明顯的.由于這是在擬南芥Trx-f或菠菜存在時用DTT/GSSG對煙草的RCA進(jìn)行處理得到的結(jié)果,而擬南芥和菠菜同屬于非茄科植物,而煙草屬于茄科植物,而RCA具有明顯的茄科特異性.因此,在菠菜和煙草Trx-f存在時對煙草RCA進(jìn)行處理來進(jìn)行活力的對比測定很有必要.實驗結(jié)果顯示(圖5),當(dāng)菠菜Trx-f存在時,DTT處理對煙草RCA的活力基本沒有影響,為未處理對照的102%,這與Zhang等的結(jié)果基本一致;而當(dāng)煙草Trx-f存在時,DTT處理使得煙草RCA活力顯著增加,為對照的227%;隨后加入等量GSSG抵消DTT的還原效應(yīng),煙草RCA 活力又基本回到了初始水平,為對照的98%.上述結(jié)果驗證了不同光強(qiáng)以及突變體得到的結(jié)果,即煙草RCA活力也接受氧化還原狀態(tài)的調(diào)控;而且與Zhang等的報道一致,煙草RCA的氧化還原調(diào)控也是Trx-f介導(dǎo)的.Zhang等[8]沒有發(fā)現(xiàn)煙草RCA接受氧化還原調(diào)控的主要原因是因為他們實驗中只用了擬南芥/菠菜的Trx-f而沒有用煙草的.這結(jié)果還暗示著Trx-f介導(dǎo)的RCA氧化還原調(diào)控可能與RCA活化Rubisco存在茄科專一性[22]相似,存在某種形式的種屬差異性.

WT:野生型煙草; ΔndhCKJ:ndhC亞基、ndhK亞基、ndhJ亞基缺失煙草突變體. **表示1%的顯著水平.雙尾student t-test,n=3.

1:未處理對照; 2:煙草Trx-f存在條件下,用DTT處理RCA 5 min; 3:在2條件下,再額外加入GSSG處理5 min; 4:在菠菜Trx-f存在時,用DTT處理RCA 5 min.DTT與GSSG在反應(yīng)體系中終濃度均為2 mmol·L-1.雙尾student t-test,n=4.**表示1%的顯著水平.

1:未處理對照; 2:煙草Trx-f存在條件下,用DTT處理RCA 5 min;3:在2條件下,再額外加入GSSG處理5 min; 4:在菠菜Trx-f存在時,用DTT處理RCA 5 min.DTT與GSSG在反應(yīng)體系中終濃度均為2 mmol·L-1.雙尾student t-test,n=4.**表示1%的顯著水平.

進(jìn)一步利用煙草和菠菜Trx-f對另外一種來自番茄的單亞型RCA活力進(jìn)行處理.實驗結(jié)果與煙草RCA基本一致(圖6).煙草Trx-f存在時DTT處理顯著促進(jìn)了番茄RCA的活力,上升了88%,同樣額外加入GSSG可逆轉(zhuǎn)DTT處理的促進(jìn)效果.而當(dāng)用菠菜Trx-f替代煙草Trx-f后,DTT處理后番茄RCA活力為對照的107%,沒有明顯作用.這表明煙草Trx-f不僅可以介導(dǎo)自身RCA而且還可以介導(dǎo)同是單亞型的番茄RCA的氧化還原狀態(tài)的改變,但雙亞型RCA物種菠菜的Trx-f卻不能.這初步驗證了前面關(guān)于RCA氧化還原調(diào)控可能存在茄科特異性的推測.

2.4 不同氧化還原狀態(tài)下菠菜和煙草Trx-f對雙亞型RCA活力的影響

前面的實驗結(jié)果表明是煙草而不是菠菜的Trx-f才能介導(dǎo)單亞型RCA的氧化還原狀態(tài)的改變,從而引起其活力變化.為了進(jìn)一步闡明Trx-f介導(dǎo)的RCA活力氧化還原調(diào)控的種屬專一性,進(jìn)一步在菠菜和煙草的Trx-f存在時,用DTT/GSSG處理雙亞型RCA后對其活力進(jìn)行了測定.

首先對菠菜RCA進(jìn)行處理.與以往研究結(jié)果一致,結(jié)果顯示在菠菜Trx-f存在的情況下,DTT處理使得菠菜RCA活力上升了152%,達(dá)到了極顯著的水平.但當(dāng)隨后加入等量的GSSG后,菠菜RCA活力基本回到了初始水平,是對照的91%.而用煙草Trx-f代替菠菜Trx-f后,DTT處理對菠菜RCA活力沒有影響.上述結(jié)果表明與菠菜Trx-f不能介導(dǎo)煙草RCA活力的氧化還原調(diào)控一樣,煙草的Trx-f也不能介導(dǎo)菠菜RCA活力的氧化還原調(diào)控.

為了進(jìn)一步驗證在菠菜中獲得的結(jié)果,又在菠菜和煙草Trx-f存在時,對擬南芥RCA進(jìn)行處理,測定結(jié)果與菠菜RCA相似(圖8),當(dāng)加入菠菜Trx-f后,DTT處理的擬南芥RCA活力上升到對照的175%,隨后加入額外的GSSG使得擬南芥RCA活力又回復(fù)到初始水平的90%.而用煙草Trx-f替代菠菜Trx-f后,DTT處理擬南芥RCA后其活力為對照的110%,沒有顯著變化.根據(jù)上述結(jié)果得出結(jié)論:菠菜的Trx-f可以介導(dǎo)自身RCA及雙亞型RCA的氧化還原狀態(tài)的改變,而不能介導(dǎo)單亞型RCA的RCA的氧化還原狀態(tài)的改變.而煙草Trx-f,則相反,只能介導(dǎo)單亞型RCA的氧化還原狀態(tài)的改變.Trx-f介導(dǎo)的RCA氧化還原狀態(tài)的改變具有的種屬專一性,與其RCA是雙亞型還是單亞型有關(guān).

1:未處理對照; 2:菠菜Trx-f 存在條件下,用DTT處理RCA 5 min; 3:在2條件下,再額外加入GSSG處理5 min; 4:在煙草Trx-f存在時,用DTT處理RCA 5 min.DTT與GSSG在反應(yīng)體系中終濃度均為2 mmol·L-1.雙尾student t-test,n=4.**表示1%的顯著水平.

1:未處理對照; 2:菠菜Trx-f 存在條件下,用DTT處理RCA 5 min; 3:在2條件下,再額外加入GSSG處理5 min; 4:在煙草Trx-f存在時,用DTT處理RCA 5 min.DTT與GSSG在反應(yīng)體系中終濃度均為2 mmol·L-1.雙尾student t-test,n=4.**表示1%的顯著水平.

3 結(jié) 論

植物碳同化酶活性普遍受葉片氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié),特別是作為光合碳同化的限速酶Rubisco.以往研究表明當(dāng)提取液中含有較高濃度的DTT時,光下植物葉片的Rubisco活力比較高.自從發(fā)現(xiàn)Rubisco的活力在體內(nèi)是由RCA活化后,人們就致力于氧化還原狀態(tài)對RCA的調(diào)控研究.很早就有文獻(xiàn)報道體內(nèi)RCA對Rubisco的活化需要電子傳遞,特別是光系統(tǒng)I的電子傳遞[23].近年來,人們還發(fā)現(xiàn)Rubisco活化的氧化還原調(diào)控是通過Trx-f對RCA的大亞型的氧化還原狀態(tài)的改變來完成:光推動的電子傳遞鏈傳遞電子給鐵氧還蛋白,鐵氧還蛋白可以提供電子給硫氧還蛋白還原酶,后者還原Trx-f,進(jìn)而完成對大亞型RCA的還原;大亞型通過RCA寡聚體中的不同亞型間的相互作用來改變小亞型RCA的氧化還原狀態(tài),從而改變其活性,但只有小亞型的RCA的活力不受氧化還原狀態(tài)調(diào)控[8].然而大量研究和實驗結(jié)果都表明,煙草等單亞型RCA物種的Rubisco活力是明顯受到不同光強(qiáng) (圖1) 和氧化還原狀態(tài)調(diào)控的(圖2～4).由此可見煙草RCA的活力同樣是受到了體內(nèi)氧化還原狀態(tài)的調(diào)控.因此人們一直努力在這些物種中尋找是否存在大亞基,這方面的工作一直沒有進(jìn)展(與Portis私人交流).

通過對Zhang等[8]的實驗結(jié)果分析后發(fā)現(xiàn),他們是用擬南芥/菠菜而不是煙草Trx-f來研究煙草RCA的氧化還原調(diào)控的,這可能會導(dǎo)致結(jié)論失之偏頗.RCA活化Rubisco時具有茄科特異性[22],這說明茄科RCA在結(jié)構(gòu)上與其他物種不同,陳娟等的工作[24]發(fā)現(xiàn)茄科的RCA基本上都是單亞型的.這可能是煙草RCA不受擬南芥的Trx-f的調(diào)控的一個重要的原因.單亞型RCA氧化還原調(diào)控只能由煙草Trx-f介導(dǎo),而雙亞型RCA氧化還原狀態(tài)的改變只能由菠菜Trx-f介導(dǎo)的結(jié)果驗證了上述推測,表明不管是單亞型還是雙亞型RCA活力都受氧化還原調(diào)控,都是Trx-f介導(dǎo)的.而Trx-f介導(dǎo)RCA氧化還原調(diào)控和之前報道的RCA活化Rubisco一樣[25]存在種屬專一性,但不同的是這種特異性是與該物種具有的RCA是雙亞型還是單亞型有關(guān).而由于這種種屬專一性的存在導(dǎo)致了Zhang和Portis的結(jié)論存在偏差.

本研究結(jié)果說明Trx-f介導(dǎo)的RCA氧化還原調(diào)控存在種屬差異性,但導(dǎo)致其種屬差異性的內(nèi)在機(jī)制還不清楚.文獻(xiàn)報道Trx-f與大亞型的RCA的半胱氨酸位點(diǎn)與其氧化還原調(diào)控有著密不可分的關(guān)系[8],然而單亞型RCA缺失大亞型RCA中的C末端序列,因此單亞型中的半胱氨酸位點(diǎn)如何接受Trx-f的調(diào)控,以及RCA中的哪些位點(diǎn)導(dǎo)致其種屬特異性的發(fā)生,還有待于進(jìn)一步的研究.

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