植酸鈦納米材料固定酶制備過氧化氫傳感器

潘羽俠,董 潔,葉平平,李夢珠,諸瑩婕,向 媛,楊海峰

(上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海 200234)

0 引 言

近年來,具有層狀結(jié)構(gòu)的磷酸鹽已被人們廣泛研究.其制備方法一般主要有溶膠凝膠法[1]、水熱合成法[2]、溶劑熱合成法[3]等.微波合成法是最近迅速發(fā)展起來的一種綠色、快速、高效的材料合成新技術(shù)[4],自20世紀(jì)70年代中期,Hesek等[5]將微波技術(shù)應(yīng)用于分析化學(xué)中開始,微波合成法以其獨(dú)特的加熱方式受到科研人員的密切關(guān)注,并進(jìn)行了大量的相關(guān)研究工作.

目前,微波合成法已被廣泛用于磷酸鋁分子篩和硅酸鋁沸石的合成中[6-8].傳統(tǒng)的加熱方式是靠輻射、對流、傳導(dǎo)等3種方式由表及里加熱,而微波加熱不同于此,其具有其他合成方法不可比擬的優(yōu)點(diǎn):受熱均勻,加熱速度快,結(jié)晶迅速[7],粒徑小且均勻[9-11],副反應(yīng)少,產(chǎn)物相對單純[12]等.最近,有報(bào)道指出,由于微波合成法結(jié)晶迅速,應(yīng)用此方法可以使合成的產(chǎn)物孔徑增大[13].因此,微波合成法是一種有效合成材料的方法.

植酸為環(huán)境友好型的分子[14],植酸 (IP6或PA)是一類天然物質(zhì),在許多植物組織,特別是在麩類和種子中,作為磷的主要存在形式.它具備一些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn),如生物相容性好,無毒和對環(huán)境友好.符合當(dāng)今的科研時(shí)代趨勢.每個(gè)植酸分子可提供6對氫原子使自由基的電子形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu),通過研究小組前期的工作已經(jīng)了解到[15-16],將一定濃度的植酸鈉加熱,可形成植酸膠束,用于納米粒子的穩(wěn)定劑和表面活性劑,有效地保護(hù)了納米粒子.

辣根過氧化物酶 (Horseradish Peroxidase,HRP)是一種性質(zhì)穩(wěn)定,活性高、商品化較早的生物分子.它可以作為一種生物合成和轉(zhuǎn)化的試劑,被廣泛應(yīng)用在生物傳感器、廢水處理、環(huán)境化學(xué)等領(lǐng)域,是研究最多的一種過氧化物酶.過氧化物酶在生物體內(nèi)以及食物藥物中有著重要影響,生物體內(nèi)許多過氧化物酶參與的酶促反應(yīng)的副產(chǎn)物是過氧化氫 (H2O2),因此通過檢測過氧化氫的含量來研究過氧化物酶的動力學(xué)和熱力學(xué)性質(zhì),為了解生物體內(nèi)的生命現(xiàn)象提供了可能.在檢測的眾多方法中,電化學(xué)生物傳感器方法可以實(shí)現(xiàn)對H2O2的快速、高效的檢測,因此,過氧化物酶電化學(xué)傳感器在H2O2的檢測中發(fā)揮著重要作用.同時(shí),隨著酶固定化技術(shù)的發(fā)展和新檢測方法的應(yīng)用,辣根過氧化物酶傳感器的檢測性能不斷提高,應(yīng)用領(lǐng)域也不斷拓展.

本研究嘗試?yán)梦⒉ê铣煞焖俸铣杉{米植酸鈦材料,并通過FESEM表征發(fā)現(xiàn)它具有多孔結(jié)構(gòu).進(jìn)而,運(yùn)用這種材料結(jié)合混合滴涂的方法將HRP成功修飾到電極表面制備了一種過氧化氫傳感器.紫外可見光譜和電化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了這種材料良好的生物相容性,該法制備的生物傳感器表現(xiàn)出良好的電化學(xué)性能.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

硫酸鈦 (分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；植酸鈉 (IP6,分析純,Aldrich公司)；辣根過氧化物酶 (HRP,EC 1.11.1.7,RZ>3.0,A>250 U·mg-1,上海麗珠東風(fēng)生物科技有限公司)；磷酸鹽緩沖溶液 (PBS,67 mmol·L-1)由KH2PO4和Na2HPO4調(diào)配而成,不同pH的緩沖溶液用0.1 mol·L-1的NaOH與H3PO4調(diào)節(jié)得到；所有實(shí)驗(yàn)用水均為超純水 (18.2 MΩ·cm).

1.2 儀 器

CHI660D型電化學(xué)工作站 (上海辰華儀器有限公司),電化學(xué)實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)三電極體系:修飾電極 (自制)為工作電極,鉑電極作輔助電極,飽和甘汞電極作參比電極；760CRT型紫外可見分光光度計(jì) (上海精密科學(xué)儀器有限公司)；場發(fā)射掃描電子顯微鏡 (FESEM)圖由Hitachi S-4800型掃描電鏡得；FE20型pH計(jì) (上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；SK2200H型超聲清洗器 (上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 植酸鈦納米粒子的制備

將植酸鈉 (IP6)溶液加熱至沸騰,然后將硫酸鈦酸性溶液 (植酸鈉和硫酸鈦溶液的摩爾比為1∶3)加入上述溶液中,混合均勻后轉(zhuǎn)移到微波反應(yīng)器中,在100℃條件下反應(yīng)40 min.冷卻后離心(7000 r/min),用超純水清洗后再分散,即得到納米植酸鈦分散液.

1.3.2 修飾電極的制備

玻碳電極經(jīng)砂紙打磨,超純水超聲清洗后,用0.3 μm的α-Al2O3粉末在麂皮上拋光,然后分別用超純水、乙醇、超純水超聲清洗,用N2吹干.

首先取相同體積的植酸鈦分散液和5 mg·mL-1的HRP (pH=5.5),離心管中混合均勻,然后移取3 μL混合溶液滴在處理干凈的玻碳電極表面,置于冰箱中4℃下晾干,后用蒸餾水洗凈,晾干,就得到了辣根過氧化物酶-植酸鈦修飾的玻碳電極,將其置于4℃冰箱中儲存?zhèn)溆?修飾電極記作HRP/Ti-IP6/GCE.另外,按相同的方法制備修飾電極Ti-IP6/GCE做對比.

1.3.3 電化學(xué)測量方法

連接三電極系統(tǒng),鉑電極為輔助電極,飽和的甘汞電極為參比電極,修飾電極為工作電極.向一定量的PBS (pH=7.0)溶液中通高純氮?dú)庖欢〞r(shí)間,以消除溶液中氧氣的干擾.循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)在靜止溶液中操作,而計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)應(yīng)在持續(xù)穩(wěn)定攪拌的溶液中進(jìn)行,待基線電流穩(wěn)定后,加入一定量的H2O2,記錄電流響應(yīng)值.

2 結(jié)果與討論

2.1 場發(fā)射掃描電子顯微鏡 (FESEM)表征

圖1 (A)是植酸鈦納米粒子的FESEM圖,(B)是植酸鈦與HRP等體積混合后的FESEM圖.通過FESEM比較可以看出,制備所得的植酸鈦納米粒子是形貌不規(guī)則且具有孔狀結(jié)構(gòu)的,當(dāng)植酸鈦與HRP混合后,發(fā)現(xiàn)形貌發(fā)生了改變,HRP在植酸鈦表面上形成了一層薄膜,說明HRP很好地修飾到植酸鈦上,這種結(jié)構(gòu)也有助于實(shí)現(xiàn)直接的電子轉(zhuǎn)移.

圖1 Ti-IP6 (A)和HRP/Ti-IP6 (B)的FESEM圖

2.2 紫外可見光譜 (UV-vis)表征

圖2分別考察了植酸鈦分散液、HRP以及它們的混合物的紫外可見吸收曲線.曲線 (a)是植酸鈦分散液的紫外可見吸收曲線,可以看出它在300～800 nm波長范圍內(nèi)沒有明顯的吸收峰.曲線 (b)是HRP溶液的紫外可見吸收曲線,397 nm處的吸收峰歸屬于HRP中三價(jià)鐵的Soret吸收帶,而植酸鈦與HRP混合溶液 (c)的紫外可見吸收曲線中,這個(gè)峰位于396 nm處,這與HRP的吸收曲線相比,只有1 nm的位移.同時(shí),在這兩條吸收曲線中,500 nm和640 nm處歸屬于HRP的Q和CT吸收帶都存在,且峰形和峰位置完全沒有改變.以上表明修飾的HRP仍然保持其原有的生物活性,也證明了植酸鈦納米材料具有一定的生物親和性.

圖2 Ti-IP6(a)，HRP(b)和HRP/Ti-IP6(c)的紫外可見光譜圖

2.3 HRP在修飾電極上的直接電化學(xué)

圖3是裸玻碳電極和不同修飾電極在PBS (pH=7.0)中的循環(huán)伏安曲線,從圖3中可以看出,裸玻碳電極 (a)和修飾電極Ti-IP6/GCE (b)在PBS (pH=7.0)溶液中均沒有觀察到明顯的氧化還原峰,說明植酸鈦是一種非電活性的材料.而在修飾電極HRP-Ti-IP6/GCE (c)的CV曲線上有一對明顯的氧化還原峰,這對氧化還原峰同樣來源于HRP的血紅素中FeⅢ/Ⅱ的氧化還原反應(yīng),說明HRP已成功地固定到玻碳電極表面且保持了生物電活性,同樣證明植酸鈦納米粒子為HRP提供了一個(gè)良好的生物親和界面,實(shí)現(xiàn)了HRP與玻碳電極間的直接電子轉(zhuǎn)移.另外,當(dāng)掃速為300 mV·s-1時(shí),修飾電極的陽極峰電位Epa=-0.331 V,陰極峰電位Epc=-0.402 V,△Ep=71 mV,式量電位E0′=-0.367 V,說明該電極反應(yīng)是一個(gè)準(zhǔn)可逆反應(yīng)過程.

圖3 修飾電極裸GCE(a),Ti-IP6/GCE (b)和HRP-Ti-IP6/GCE(c)在PBS (pH=7.0)中的循環(huán)伏安曲線(掃速:300 mV·s-1)

2.4 修飾電極不同掃速的循環(huán)伏安曲線

圖4研究了修飾電極HRP-Ti-IP6/GCE在PBS (pH=7.0)溶液中不同掃速下的循環(huán)伏安行為,以及峰電流與掃速之間的關(guān)系.由圖4中發(fā)現(xiàn),隨著掃描速度的增加,修飾電極的氧化還原峰電流也在不斷地增加,且當(dāng)掃描速度在100～500 mVs-1范圍內(nèi)變化時(shí),修飾電極的氧化還原峰電流與掃速成線性關(guān)系 (見圖4插圖),說明在該掃描速率范圍內(nèi)電極反應(yīng)是一個(gè)表面控制的電極反應(yīng)過程,并進(jìn)一步證明了HRP成功固定到電極表面,保持了良好的生物活性.

圖4 HRP-Ti-IP6/GCE在PBS (pH=7.0)溶液中不同掃速:100,200,300,400,500 mV·s-1下的循環(huán)伏安曲線(插圖:峰電流與掃速的線性關(guān)系)

2.5 溶液pH對修飾電極的影響

利用循環(huán)伏安法研究了修飾電極的式量電位E0′與溶液pH值之間的關(guān)系,以此考察修飾電極的循環(huán)伏安行為受外部溶液pH值的影響.圖5是修飾電極HRP-Ti-IP6/GCE在不同pH的PBS溶液中的循環(huán)伏安曲線.由圖5可見,當(dāng)PBS溶液的pH值在4～9之間改變時(shí),循環(huán)伏安曲線的氧化還原峰電位隨緩沖溶液pH值的增加而負(fù)移,并且修飾電極的式量電位E0′與溶液的pH值呈線性關(guān)系,斜率為-53 mV·pH-1(見圖5插圖).這一斜率值接近于伴隨一個(gè)質(zhì)子轉(zhuǎn)移的單電子的可逆電極反應(yīng)的理論值-59 mV·pH-1[17].

2.6 修飾電極對過氧化氫的電催化還原

圖6是修飾電極HRP-Ti-IP6/GCE對H2O2的電催化還原行為的研究.當(dāng)在PBS中加入H2O2后,

圖5 不同pH值的PBS溶液中修飾電極的循環(huán)伏安曲線(插圖:式量電位與pH的關(guān)系.掃速:200 mV·s-1)

修飾電極的CV曲線峰形發(fā)生了很大的改變,與未加H2O2的CV曲線 (a)相比,隨著加入H2O2濃度增大,催化曲線的還原峰電流增大,氧化峰電流減小甚至消失.由此可見,修飾電極HRP-Ti-IP6/GCE對H2O2有良好的電催化還原作用,同時(shí)也進(jìn)一步證明植酸鈦納米粒子保持了HRP的電催化活性.

圖6 修飾電極在不含(a)及含不同濃度的H2O2(b～d)在PBS溶液 (pH 7.0)中的循環(huán)伏安曲線(掃速:200 mV·s-1)

2.7 計(jì)時(shí)電流響應(yīng)

圖7 HRP-Ti-IP6/GCE在PBS (pH=7.0)中連續(xù)加入H2O2的計(jì)時(shí)電流響應(yīng)曲線(工作電位:-240 mV;插圖:響應(yīng)電流與H2O2濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線)

2.8 穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

通過循環(huán)伏安法對修飾電極HRP-Ti-IP6/GCE的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察.在PBS (pH=7.0)中以200 mV·s-1進(jìn)行連續(xù)100圈的循環(huán)伏安掃描,其電流響應(yīng)沒有明顯變化.將修飾電極置于PBS (pH=7.0)中4 ℃條件下保存40 d后進(jìn)行CV掃描,其響應(yīng)電流為初始電流的91%,表明制備的傳感器有良好的穩(wěn)定性.

利用計(jì)時(shí)電流法考察了修飾電極的重現(xiàn)性.結(jié)果顯示:該修飾電極對1 μmol·L-1H2O2溶液重復(fù)5次測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (R.S.D.)是2.85%.3支相同方法制備的修飾電極,在同一條件下對1 μmol·L-1H2O2的電流響應(yīng)的R.S.D.為3.0 %,說明該傳感器有良好的重現(xiàn)性.

3 結(jié) 論

利用植酸鹽分子中磷酸基團(tuán)與部分金屬離子的強(qiáng)絡(luò)合能力,通過微波合成法合成了新穎的植酸鈦納米材料,并運(yùn)用這種材料結(jié)合混合滴涂的方法將HRP成功修飾到固定到玻碳電極表面.紫外可見光譜和電化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了這種材料良好的生物相容性,有利于防止酶在固定化過程中生物活性的損害.此法制備的生物傳感器實(shí)現(xiàn)了HRP和玻碳電極之間的直接電子轉(zhuǎn)移,且對過氧化氫呈現(xiàn)出良好的電催化還原作用,同時(shí)具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性.

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