溶藻細(xì)菌MT22的形態(tài)學(xué)觀察和分子鑒定

陳 敏，賈瑞亨

（杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州310036）

近十年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，越來(lái)越多的生活、工業(yè)、農(nóng)業(yè)污水被排放到江河流域中，直接造成自然界水體的富營(yíng)養(yǎng)化，進(jìn)而爆發(fā)“藻類水華”，嚴(yán)重影響社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展［1-3］.水體的富營(yíng)養(yǎng)化將是中國(guó)今后相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)期內(nèi)的重大水環(huán)境問(wèn)題，尋求有效的水華防治方法勢(shì)在必行［4-6］.

筆者前期分離獲得一株具有高效溶藻效果的溶藻細(xì)菌MT22（研究結(jié)果另文報(bào)道），本文結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定以及16S r RNA 基因測(cè)序的方法對(duì)其進(jìn)行菌種的鑒定，以期為溶藻細(xì)菌在生物控藻方面的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 藻種

銅綠微囊藻（Microcystisaeruginosa），培養(yǎng)條件為：25±0.5 ℃，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx，光暗周期比14 h∶10 h.

1.2 菌種

溶藻細(xì)菌MT22：由本實(shí)驗(yàn)室從養(yǎng)殖塘底泥中分離得到，并經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)證明有較強(qiáng)溶藻效果.37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)后于4 ℃冰箱中保存，以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用.

1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g／L，NaCl 10.0 g／L，瓊脂15.0 g／L，酵母提取物5.0 g／L，p H 為7.2～7.4.

BG11培養(yǎng)基：NaNO31.5 g／L，K2HPO40.04 g／L，MgSO4·7H2O 0.075 g／L，CaCl2·7H2O 0.036 g／L，Na2CO30.02 g／L，檸檬酸0.006 g／L，檸檬酸鐵0.006 g／L，微量元素溶液A5 1 m L，氨芐青霉素50 g／L，瓊脂20 g／L，p H7.1.

1.4 形態(tài)學(xué)觀察

1.4.1 菌落觀察 取試管斜面保藏的菌種少許，在LB固體平板培養(yǎng)基上劃線，倒置在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，觀察平板上單菌落的形態(tài)特征，包括顏色、大小、形狀、邊緣、表面突起及透明程度等［7］.

1.4.2 菌體形態(tài)觀察 挑取少許菌苔，經(jīng)涂片、干燥、固定、染色、水洗、干燥后置于顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)、大小等，并記錄［7］.

1.4.3 革蘭氏染色 涂片方法同上.革蘭氏染色用結(jié)晶紫初染90 s，水洗，滴加盧戈氏（Lugol's）碘液沖去殘水，覆蓋1 min，水洗，95%的乙醇滴洗，直至流出的液體不呈紫色，約20～30 s，立即水洗，0.5% 番紅水溶液復(fù)染1～2 min，水洗，晾干后鏡檢.呈紫色的為革蘭陽(yáng)性菌，呈紅色的為革蘭陰性菌［7］.

1.4.4 芽孢染色 按常規(guī)方法取少許菌苔涂片、干燥及固定，滴加5%孔雀綠水溶液加熱染色5 min，水洗，0.5%番紅水溶液復(fù)染2 min，水洗至無(wú)色，待載玻片晾干后油鏡鏡檢［7］.

1.5 生理生化試驗(yàn)

根據(jù)形態(tài)鑒定結(jié)果，選擇合適的測(cè)試鑒定卡，按照VITEK?2 COMPACT 全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)儀器說(shuō)明書(shū)中的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行［8］.

1.6 16S r RNA 基因測(cè)序

1.6.1 基因組DNA 的提取 采用細(xì)菌基因組提取試劑盒方法（生工生物公司SK8226）.

1.6.2 PCR 擴(kuò)增 采用細(xì)菌16S r RNA 通用引物P0和P6，上游引物P0：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游引物P6：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'.

PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min（30個(gè)循環(huán)），72 ℃充分延伸20 min.

1.6.3 基因測(cè)序 將PCR 產(chǎn)物回收.PCR 產(chǎn)物的純化、克隆和測(cè)序由上海英俊生物技術(shù)有限公司完成.

1.6.4 序列同源性比較 測(cè)序結(jié)果提交到GenBank得到基因序列登錄號(hào).通過(guò)在GenBank等國(guó)際核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)進(jìn)行同源序列搜索，找出該株菌與數(shù)據(jù)庫(kù)中同源性最高的模式菌株或保藏在ATCC、DSM等國(guó)際菌種保藏中心的菌株.

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

MT22溶藻細(xì)菌在固體LB培養(yǎng)基上形成的菌落呈白色，形狀為圓形，較小，菌落干燥、表面扁平、邊緣呈褶皺狀、質(zhì)地致密（圖1）.

菌體形態(tài)為桿狀（圖2），菌體大小為4.1μm×1.0μm.革蘭氏染色陽(yáng)性，菌體中有芽孢（圖3）.

圖1 MT22菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strain MT22

圖2 MT22菌體形態(tài)Fig.2 Cell morphology of strain MT22

圖3 芽孢染色Fig.3 Spore staining

2.2 生理生化反應(yīng)鑒定

經(jīng)VITEK?2 COMPACT（全自動(dòng)微生物分析儀）分析，MT22溶藻細(xì)菌的生理生化指標(biāo)如表1 所示，鑒定報(bào)告中顯示結(jié)果為：解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens），94%可能性.

表1 MT22菌株生理生化試驗(yàn)Tab.1 Morphophysiological characteristics of strain MT22 by VITEK?2 COMPACT tests

2.3 16S r RNA 基因測(cè)序

擴(kuò)增MT22菌株的16S r RNA 基因序列，將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果提交到GenBank，得到基因序列登錄號(hào)為JQ859918.Blast比對(duì)結(jié)果表明，菌株MT22與解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensRx-35（JN086147.1）的同源性達(dá)99%.

綜合以上結(jié)果，初步鑒定MT22菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）.

3 討 論

20世紀(jì)80年代之前，細(xì)菌的分類和鑒定主要依靠形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征和免疫學(xué)反應(yīng)進(jìn)行.這些方法在細(xì)菌分類鑒定中發(fā)揮過(guò)重要作用，但也存在著鑒定準(zhǔn)確性差、繁瑣耗時(shí)等缺點(diǎn).隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，細(xì)菌的鑒定開(kāi)始進(jìn)入分子水平，其中，16S r RNA 基因的同源性分析已經(jīng)成為細(xì)菌種屬鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法，在細(xì)菌的分類研究中起著重要的作用［9］.細(xì)菌的16S r RNA 序列長(zhǎng)約1.6 kb左右，其序列變化速度與進(jìn)化速率相適應(yīng)，因此被廣泛用于種屬鑒定［10］.隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的微生物的16S r RNA 序列被收入基因數(shù)據(jù)庫(kù)，這使得用16S r RNA 測(cè)序分析鑒定細(xì)菌更加快捷方便.

VITEK?2 COMPACT 是生物梅里埃公司集合多年的微生物鑒定經(jīng)驗(yàn)，于2005年推出的一代新的微生物鑒定智能系統(tǒng)，為快速、正確的細(xì)菌學(xué)報(bào)告創(chuàng)造了物質(zhì)基礎(chǔ)，使得細(xì)菌檢驗(yàn)水平獲得了質(zhì)的飛躍［11］.在細(xì)菌檢驗(yàn)中以自動(dòng)化系統(tǒng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的手工操作是當(dāng)代臨床檢驗(yàn)進(jìn)步的標(biāo)志之一.

解淀粉芽孢桿菌是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細(xì)菌.最近幾年大量學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌在自然生長(zhǎng)過(guò)程中可以產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，能夠強(qiáng)烈抑制多種細(xì)菌和真菌，如可以抑制鐮刀菌、曲霉、青霉、毛霉等引起食品腐敗的真菌［12］，抑制多種病原菌如李斯特菌的生長(zhǎng)，有些解淀粉芽孢桿菌還對(duì)大豆根腐病菌有很高的抑菌率［13］.目前對(duì)于解淀粉芽孢桿菌在溶藻方面的研究還比較少.

本研究以細(xì)菌16S r RNA 一對(duì)通用引物，對(duì)MT22菌株進(jìn)行16S r RNA 序列同源性分析.擴(kuò)增結(jié)果與GeneBank上的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，MT22 菌株與解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）序列比較同源性為99%.為了進(jìn)一步證實(shí)鑒定結(jié)果，進(jìn)行了生理生化鑒定，結(jié)果表明，其主要特征與解淀粉芽孢桿菌吻合.因此，初步鑒定MT22菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）.

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