離子色譜法測定果汁中乳酸、富馬酸、檸檬酸的含量

王昌釗，郭婕，吳雙民，李仁勇

[1.陜西出入境檢驗檢疫局，西安 710068； 2.西安市糧油質(zhì)量檢驗中心，西安 710003； 3.賽默飛世爾科技(中國)有限公司，北京 100080]

有機酸存在廣泛，種類繁多，是影響果汁口感和風味的重要物質(zhì)。果汁中有機酸含量的高低與果汁產(chǎn)品品質(zhì)有密切的關(guān)系［1］，同時也受到生產(chǎn)技術(shù)和加工工藝的影響。乳酸是評價果汁產(chǎn)品質(zhì)量的一項重要指標。在乳酸菌的作用下，果汁中的碳水化合物發(fā)酵生成乳酸。富馬酸一般是在合成蘋果酸的過程中產(chǎn)生，因此若蘋果汁中含有富馬酸，則有可能添加合成蘋果酸。過度的加工條件也可能產(chǎn)生富馬酸，例如果汁濃縮過程中，蘋果酸受熱就會生成富馬酸。因此相同條件下生產(chǎn)的鮮榨蘋果汁往往比濃縮蘋果汁含有較少的富馬酸。蘋果汁中檸檬酸的含量同樣也具有重要的特征和意義，當其超出一定的值(RSK值)，則表示該果汁是摻假蘋果汁。因此一些進口國對蘋果汁中的有機酸提出了比較嚴格的要求，如歐盟果蔬汁飲料協(xié)會(AIJN)［2］規(guī)定蘋果汁中乳酸的含量不得超過0.5 g／L (11.2 Brix)，富馬酸的含量不得超過5.0 mg／L(11.2 Brix)，檸檬酸的含量應(yīng)在50～150 mg／L之間，其它一些國家也有類似規(guī)定。

有機酸的分析方法通常有極譜法［3］、容量法［4–5］、分光光度法［6–8］、氣相色譜法［9–10］、高效液相色譜法［11–15］、離子色譜法［16–20］等。農(nóng)業(yè)部標準《果汁測定方法 乳酸的測定》是試樣經(jīng)脫糖氧化后蒸餾，用碘量滴定法測定［4］?！豆瓬y定方法 檸檬酸的測定》則是將有機酸以鋇鹽形式分離以后，利用檸檬酸與重氮化磺胺酸的特效反應(yīng)，利用分光光度法比色測定［6］。以上檢測步驟繁瑣，所用試劑較多，花費時間過長。高效液相色譜法雖可以同時測定乳酸、檸檬酸、富馬酸，但由于有機酸沒有末端吸收，需要長時間穩(wěn)定紫外檢測器，且方法的分離度和靈敏度偏低，在實際樣品分析時乳酸分離效果并不理想。離子色譜儀配備抑制型電導檢測器，檢測有機酸的靈敏度較高，因此筆者采用離子色譜法測定了果汁中的乳酸、檸檬酸、富馬酸，測定結(jié)果準確可靠。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

離子色譜儀：Dionex ICS–5000型，附帶Chromeleon工作站，美國賽默飛公司；

淋洗液發(fā)生罐：EGC–KOH Ⅲ型，美國賽默飛公司；

乳酸、富馬酸、檸檬酸：優(yōu)級純，天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心；

OnGuard II RP固相萃取小柱：1.0 mL，美國賽默飛公司；

濃縮蘋果汁、濃縮梨汁：陜西出口產(chǎn)品；

實驗用水為超純水(電阻率不小于18.2 MQ·cm)。

1.2 色譜條件

色譜柱：Dionex IonPac AS19型(250 mm×4 mm，美國賽默飛公司)；保護柱：IonPac AG19型(250 mm×4 mm，美國賽默飛公司)；流動相：氫氧化鉀溶液，梯度淋洗，氫氧化鉀溶液濃度0～15 min為2 mmol／L，15～30 min為2～40 mmol／L，30～40 min為40 mmol／L，40～43 min為2 mmol／L，流量為1 mL／min；抑制器：連續(xù)自動再生膜陰離子抑制器；檢測方式：抑制型電導檢測器(配ASRS 300型微膜電抑制器，自循環(huán)電抑制，抑制電流為99 mA)；柱溫：30℃，進樣體積：25 μL。

1.3 標準溶液的配制

有機酸混合標準溶液：稱取一定量的乳酸、富馬酸、檸檬酸，用超純水配成1 000 mg／L的混合標準溶液，其中乳酸的濃度是混合標準溶液經(jīng)加熱回流15 h后，以氫氧化鈉標準溶液進行標定所得。

1.4 樣品的制備

果汁樣品的制備：準確量取6 mL樣品(精確至0.05 mL)置于50 mL容量瓶中，用超純水稀釋定容到標線，搖勻后過0.22 μm尼龍濾膜和On-guard II RP固相萃取小柱(小柱使用前分別用5 mL甲醇和10 mL去離子水以2 mL／min的流速活化)，棄去3 mL初濾液，續(xù)濾液收集后進樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱及淋洗條件的選擇

蘋果汁中3種待測有機酸成分中，乳酸的色譜保留非常弱，富馬酸和檸檬酸則保留非常強，色譜柱選擇時需兼顧3者的分離效果。常用的陰離子交換體系主要有兩種：碳酸鹽和氫氧化物。以氫氧根為淋洗液的色譜柱其固定相官能團烷醇基季銨鹽的親水性比碳酸鹽體系柱對應(yīng)官能團烷基季銨鹽強，對強保留組分陰離子具有更好的洗脫能力。因為氫氧化物體系具有強堿性，多價離子以高價離子形態(tài)存在，色譜峰形對稱尖銳，靈敏度高。綜上兩點，選擇使用氫氧根體系色譜柱。比較了7種最常見的AS11–HC，AS15，AS16，AS17，AS18，AS19，AS20色譜柱。實驗發(fā)現(xiàn)，AS11–HC色譜柱對多種有機酸的同時分析具有優(yōu)勢，但是對于乳酸、乙酸和氟分離度較差，草酸和富馬酸也很難實現(xiàn)基線分離，其余如AS16，AS17都有類似的分離情況。AS15，AS18和AS20上則對乳酸、乙酸分離較差。在AS19柱上乳酸與常見有機酸能實現(xiàn)基線分離，富馬酸和檸檬酸也基本不存在干擾，因此選擇AS19柱對淋洗條件進一步優(yōu)化。最終確定氫氧化鉀溶液梯度淋洗條件：0～15 min，2 mmol／L；15～30 min，2～40 mmol／L；30～40 min，40 mmol／L；40.1～43 min，2 mmol／L。在此條件下，樣品中有機酸的分離度基本都能達到1.5以上，離子色譜圖見圖1。

圖1 混合標準溶液離子色譜圖

2.2 方法的檢出限、定量限和線性方程

按照有機酸的色譜響應(yīng)特性，配制系列乳酸、富馬酸、檸檬酸混合標準溶液，按1.2節(jié)色譜條件進行測定，以各待測物的平均色譜峰面積y對其質(zhì)量濃度x(mg／L)進行回歸，其線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍見表1。由表1可知，3種待測有機酸在各自的濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)均不小于0.999。采用在空白基質(zhì)中添加目標組分的方法，依據(jù)色譜峰的信噪比(S／N)等于3確定檢出限(LOD)，S／N等于10確定定量限(LOQ)，得到3種有機酸的LOD和LOQ見表2。考慮到樣品前處理的稀釋倍數(shù)，可換算得到樣品(11.2 Brix)中測定低限(定量限)分別為0.5，0.3，0.2 mg／L。

表1 方法的檢出限、定量限和線性范圍

2.3 精密度試驗

按照1.3方法對樣品進行前處理，按1.2色譜條件直接在離子色譜系統(tǒng)上進樣分析，外標法定量。對典型的濃縮蘋果汁和脫色蘋果汁樣品溶液重復(fù)處理6次，分別進樣測試，乳酸和檸檬酸的相對標準偏差在0.41%～0.63%之間，富馬酸的相對標準偏差為1.43%，1.45%，結(jié)果見表2，表明方法具有良好的重現(xiàn)性。

表2 方法的精密度

2.4 回收試驗

在典型蘋果汁樣品溶液(濃縮蘋果清汁和脫色蘋果汁)中添加乳酸、檸檬酸、富馬酸的混合標準溶液，進行加標回收試驗，結(jié)果見表3。

表3 方法的加標回收率

由表3可知，加標回收率為90.7%～102.8%，表明方法具有良好的準確度。濃縮蘋果清汁樣品色譜圖見圖2。

圖2 濃縮蘋果清汁樣品譜圖

按此方法測試了多種果汁樣品中的乳酸、富馬酸和檸檬酸含量，表4中列出了幾種典型樣品的測試結(jié)果。

表4 樣品中乳酸、富馬酸、檸檬酸的檢出結(jié)果

3 結(jié)語

離子色譜法測定蘋果汁中的乳酸、檸檬酸和富馬酸，具有良好的分離能力。對于富馬酸的定量限可以達到0.2 mg／L(11.2 Brix)，可滿足AIJN［2］的檢測要求5 mg／L(11.2 Brix)，靈敏度明顯優(yōu)于傳統(tǒng)液相色譜法。該方法簡便、可靠，精密度好，成本低，此方法也可適用于其它果汁、飲料、白酒、葡萄酒中有機酸的測定。

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