長根金星蕨總黃酮抗氧化活性研究

文美瓊，李 璐，蔡晨波，吳仕軍，唐晶梅，徐成東

(楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 楚雄 675000)

蕨類植物是傳統(tǒng)的中草藥和現(xiàn)代醫(yī)藥的組成部分。中國人民很早就認(rèn)識到藥用蕨類植物具有疏經(jīng)活血、除濕鎮(zhèn)痛、清熱滑腸、止咳化痰、利尿安神、止血、驅(qū)蟲、解毒、抗菌、抗癌、抗HIV等多種功效［1］。近年來，國內(nèi)外在尋找新藥資源時，對蕨類藥用植物的研究日益重視［2］。云南省有蕨類植物1000余種，居全國第一，被譽為蕨類植物王國［3］，其中哀牢山國家級有蕨類植物446種，藥用蕨類植物有178種［4］。

黃酮類化合物 (flavonoids)由于具有許多有益的生物學(xué)活性，如抗腫瘤作用，防治心腦血管系統(tǒng)疾病和呼吸系統(tǒng)疾病作用，抗氧化抗衰老作用，抗菌、抗病毒作用，免疫調(diào)節(jié)作用，抗炎鎮(zhèn)痛作用，抗糖尿病作用，抗輻射作用，酶抑制劑作用，影響神經(jīng)中樞系統(tǒng)作用，激素樣作用等［5—7］，近年來逐漸成為研究熱點，尤其是其抗氧化作用。

有文獻(xiàn)報道黃酮類化合物在蕨類植物中廣泛分布，已發(fā)現(xiàn)有11大類黃酮類化合物分布在蕨類植物中［8］。

長根金星蕨 (Parathelypteris beddomei)作為金星蕨科金星蕨屬的一種藥用蕨類植物，人們對它的藥理作用有一定的研究，如具有消炎止血作用，用于主治外傷出血［9］，但對其總黃酮含量的測定及抗氧化活性的研究卻未見報道。本文對采自云南哀牢山的長根金星蕨中總黃酮含量進(jìn)行測定，并對其抗氧化活性進(jìn)行研究，旨在對云南哀牢山藥用蕨類植物的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料:長根金星蕨由楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院徐成東教授采自云南哀牢山并鑒定。

儀器:754型紫外可見分光光度計 (上海第三分析儀器廠制造)。

試劑:蘆丁 (日本和光純藥工業(yè)株式會社);鯡魚精DNA(Sigma公司);Tris(生化試劑);硫代巴比妥酸 (生化試劑);其余試劑均為國產(chǎn)分析純。水為實驗室自制超純水。

1.2 總黃酮成分提取

將長根金星蕨全草晾干，粉碎。準(zhǔn)確稱取3g樣品，經(jīng)石油醚脫脂后用70%乙醇于85℃索式提取至溶液將近無色，提取時間為4h。濃縮，定容于100mL容量瓶得樣品液。

1.3 提取液總黃酮成分的鑒別［10］

取樣品液1mL于試管中，用Al(NO3)3、NaOH、濃H2SO4、FeCl3、濃氨水、HCl－Zn等進(jìn)行顯色反應(yīng)，對總黃酮成分進(jìn)行鑒別。

1.4 總黃酮含量測定

參照文獻(xiàn)［11］，用NaNO2－Al(NO3)3－NaOH分光光度法測定總黃酮含量，三次重復(fù)。

1.5 抗氧化活性研究

1.5.1 總黃酮提取物對羥自由基清除作用

利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基［12］。在10mL比色管中加入9mmol/L FeSO4溶液2.0mL，9mmol/L水楊酸一乙醇溶液2.0mL，不同濃度的總黃酮提取液1.0mL，最后加8.8mmol/L H2O2溶液2.0mL啟動反應(yīng)。加蒸餾水定容至刻度，37℃反應(yīng)0.5h。以蒸餾水為參比，以試劑空白作比較，在510nm處測定各濃度的吸光度，考慮到提取液本身的吸光度，在10mL比色管中加9mmol/L FeSO4溶液2.0mL，9mmol/L水楊酸－乙醇溶液2.0mL，不同濃度的總黃酮提取液1.0mL，蒸餾水定容至刻度，37℃反應(yīng)0.5h，作為樣品液的本底吸收。

式中:Ao為空白對照溶液吸光度;Ax為樣品液吸光度;Axo為不加H2O2樣品液的本底吸光度。

1.5.2 總黃酮提取物對超氧陰離子自由基(O2－·)清除作用

采用鄰苯三酚自氧化法測定［13］。在10mL比色管中分別加入 Tris－HCl溶液 (pH 8.2)4.5mL，4.2mL超純水，混勻后在25℃水浴中保溫20min，取出后立即加入于25℃水浴預(yù)熱的3mmol/L鄰苯三酚0.3mL(以10mmol/L HCl溶液代替鄰苯三酚作空白)，迅速混勻后在325nm下每隔30s測定吸光度，到5min時停止，計算對照液吸光度隨時間的變化率F0。

依上法，在加入鄰苯三酚前先加入1.0mL不同濃度的總黃酮提取液，再依次加入Tris－HCl緩沖液，超純水，混勻后在25℃水浴中保溫20min，取出后立即加入于25℃水浴預(yù)熱的3mmol/L鄰苯三酚0.3mL，迅速混勻后在325nm下每隔30s測定吸光度，到5min時停止，計算樣品液吸光度隨時間的變化率Fx。

1.5.3 對羥自由基引發(fā)DNA損傷的抑制作用

·OH能作用于DNA鏈脫氧核糖的C1和C4上，使脫氧核糖環(huán)斷裂，造成DNA鏈降解，同時產(chǎn)生丙二醛 (MDA)類似物。硫代巴比妥酸 (TBA)可與丙二醛類似物在酸性條件下反應(yīng)生成粉紅色物質(zhì)，該物質(zhì)在532nm處具有最大光吸收。采用TBA反應(yīng)可檢測DNA脫氧核糖受·OH攻擊后所產(chǎn)生的丙二醛類似物的相對含量。

參照文獻(xiàn)［14］方法，準(zhǔn)確移取0.1mol/L Tris－HCl(pH7.0)溶液1.0mL于10mL比色管中，依次加入20μg/mL的DNA溶液1.0mL，不同黃酮濃度的樣液1.0mL，25mmol/L的FeSO4－EDTA溶液1.0mL，3%的雙氧水1.0mL，搖勻，37℃水浴保溫1.5h。然后加入28%三氯乙酸溶液2.0mL終止反應(yīng)，最后加入1%TBA溶液1.0mL。沸水浴加熱10min，冷卻后離心取上層清液，在532nm波長處測定吸光度A，空白管以1mL蒸餾水代替樣液測定A0，計算抑制率。

1.5.4 還原能力的測定

抗氧化劑通過自身的還原作用給出電子清除自由基，還原能力越強，抗氧化性則越強，因而可通過測定還原能力來測定抗氧化性。

參照文獻(xiàn)［15］方法，用普魯士藍(lán)法測定。取不同黃酮濃度的提取液各2.0mL，加入2.5mL磷酸緩沖液 (pH 6.6，0.2mol/L)，2.5mL鐵氰化鉀溶液 (質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%)。在50℃水浴中反應(yīng)20分鐘，迅速冷卻，并加入2.5mL三氯乙酸 (質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%)，以3000r/min離心10分鐘，取上清液2.5mL，并加入2.5mL水及0.5mL三氯化鐵溶液 (質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%)，混合均勻，10min后在700nm處測其吸光度。反應(yīng)物的吸光度越大，表明還原能力越強。

2 結(jié)果與討論

2.1 顯色反應(yīng)結(jié)果

由表1可以說明，提取物的主要成分是黃酮類化合物。

表1 70%乙醇提取液中黃酮的顏色反應(yīng)

2.2 長根金星蕨中總黃酮含量測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=18.083c+0.0045，R2=0.9995。實驗測得長根金星蕨全草中總黃酮含量為1.95%，重復(fù)性實驗見表2。

表2 重復(fù)性實驗

2.3 總黃酮提取物對羥自由基清除作用

由圖1可知，長根金星蕨總黃酮對·OH清除作用有量效關(guān)系，清除率隨著濃度增大而增大，但清除作用沒有Vc的強。

圖1 長根金星蕨對·OH的清除效果

圖2 長根金星蕨對O－2·的清除效果

2.4 總黃酮提取物對超氧陰離子自由基清除作用

由圖2可看出，長根金星蕨總黃酮對超氧陰離子自由基的清除率隨著總黃酮濃度的增大而增大，但清除作用沒有Vc的強。當(dāng)反應(yīng)體系總黃酮濃度達(dá)到11μg/mL時，繼續(xù)增大濃度，清除率改變很小。反應(yīng)體系中總黃酮對O－2·清除率達(dá)50%的濃度IC50=65μg/mL。

2.5 總黃酮提取物對羥自由基引發(fā)DNA損傷的抑制作用

由圖3可看出，加入樣品后，DNA氧化損傷受到抑制。抑制率隨著黃酮濃度的增加而增大。與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品對照，反應(yīng)體系中總黃酮對由羥自由基引發(fā)DNA損傷半抑制率為50%的濃度IC50=0.28μg/mL，而對照品蘆丁的IC50=1.1μg/mL。且當(dāng)反應(yīng)體系中總黃酮濃度小于9μg/mL時，總黃酮對由羥自由基引發(fā)DNA損傷抑制作用強于蘆丁。

圖3 長根金星蕨對·OH引發(fā)DNA產(chǎn)生MDA的抑制作用

圖4 長根金星蕨及Vc的還原能力

2.6 總黃酮提取物還原能力

從圖4中可看出，所加提取液總黃酮濃度在0.25mg/mL以下時，長根金星蕨總黃酮顯示出比Vc更強的還原能力，且還原能力隨黃酮濃度增大而線性上升。以Vc作標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線 (A=10.12c－0.00997 R2=0.9993)來計算長根金星蕨總黃酮的還原能力。測定結(jié)果為每克長根金星蕨干粉的還原能力與26.4mgVc相當(dāng) (26.4mg/g)。

3 結(jié)論

本文測得長根金星蕨中總黃酮含量為1.95%，其總黃酮提取液對活性氧自由基，特別是超氧陰離子自由基具有較強的清除作用;在一定濃度范圍內(nèi)，總黃酮提取液有比Vc還強的還原能力，且對由羥自由基引發(fā)DNA損傷的抑制作用強于蘆丁。

黃酮類化合物不僅可以抵御正常細(xì)胞由化學(xué)、物理、生物等致癌因素導(dǎo)致的DNA損傷，而且還有助于損傷DNA的修復(fù)［6］，另外，有文獻(xiàn)表明中草藥的療效與其抗氧化性密切相關(guān)［16］。其抗氧化作用機理主要是直接清除活性氧自由基;增強抗氧化酶活性;抗脂質(zhì)過氧化;減少DNA損傷;影響氧化酶系活力及表達(dá)等。

綜上所述，長根金星蕨作為天然藥物，具有較高的開發(fā)利用價值。

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