植物重金屬耐受分子機(jī)理的研究進(jìn)展

譚九洲，黃迎波(湖南出入境檢驗(yàn)檢疫局，湖南長沙410004)

土壤重金屬是指由于人類活動(dòng)將金屬加入到土壤中，致使土壤中重金屬明顯高于原生含量、并造成生態(tài)環(huán)境質(zhì)量惡化的現(xiàn)象。污染土壤的重金屬主要包括汞、鎘、鉛、鉻和類金屬砷等生物毒性顯著的元素。重金屬污染物在土壤中移動(dòng)性很小，不易隨水淋濾，不為微生物降解，通過食物鏈進(jìn)入人體后，潛在危害極大。當(dāng)土壤中重金屬離子含量超過其對重金屬離子的自凈作用時(shí)，將對植物代謝和生長發(fā)育產(chǎn)生影響。但重金屬脅迫也使某些植物產(chǎn)生了相應(yīng)耐受性，包括對重金屬的解毒和對重金屬的轉(zhuǎn)運(yùn)兩個(gè)過程。筆者對近幾年開展植物耐重金屬脅迫的分子機(jī)理方面的研究進(jìn)展作一綜述，從而從分子水平揭示植物應(yīng)對重金屬脅迫響應(yīng)中關(guān)鍵蛋白功能、表達(dá)調(diào)控，以期為今后開展提高植物重金屬耐受性的基因工程研究打下基礎(chǔ)。

1 植物蛋白的變化與抗重金屬能力之間的關(guān)系

蛋白質(zhì)組分析是鑒定植物抗重金屬能力提升過程的強(qiáng)有力的方法［1-3］。通過這種方法，已經(jīng)在多種植物中發(fā)現(xiàn)多種重金屬敏感蛋白。在這些重金屬敏感蛋白中，數(shù)量最多的一類是涉及抗氧化保護(hù)蛋白。氧化反應(yīng)一般被認(rèn)為是植物受到重金屬危害所生成的結(jié)果［4］。抗氧化保護(hù)相關(guān)蛋白中67%表達(dá)量在受重金屬處理后上調(diào)，而且上調(diào)程度又隨受重金屬處理的時(shí)間長短而不同。第二大類蛋白是那些與蛋白折疊相關(guān)的蛋白，如熱激蛋白、伴侶蛋白和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶，它們在受重金屬處理后一般表現(xiàn)為上調(diào)。這表明，蛋白質(zhì)折疊的維持和穩(wěn)定性對植物重金屬耐受性非常重要。第三大類重金屬敏感蛋白是病程相關(guān)蛋白。在17個(gè)已知的蛋白中有13個(gè)表現(xiàn)為上調(diào)。這表明植物受重金屬脅迫和生物脅迫所發(fā)生的應(yīng)激反應(yīng)之間存在緊密的聯(lián)系。發(fā)現(xiàn)有17個(gè)參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白在重金屬處理后也表現(xiàn)出差異。信號蛋白中的受體激酶和細(xì)胞壁相關(guān)蛋白激酶在受鎘、銅和鋁處理后表現(xiàn)為上調(diào)，可能是一個(gè)重要的金屬傳感系統(tǒng)組件。其他兩類重金屬敏感蛋白分別是:參與脂質(zhì)代謝的蛋白，蛋白和離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。它們在重金屬處理后通常都上調(diào)，因此它們有可能成為重金屬監(jiān)測系統(tǒng)中的組成部分。脂質(zhì)代謝蛋白表達(dá)上調(diào)可能是對重金屬在脂質(zhì)雙層組合物的負(fù)面影響下的一種直接反應(yīng)。大多數(shù)參與蛋白和離子轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白在應(yīng)對重金屬響應(yīng)時(shí)表現(xiàn)出了差異，因此它們就是調(diào)節(jié)液泡前體艙室和液泡之間的胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸?shù)馁|(zhì)子泵［5］。這種運(yùn)輸途徑可能與細(xì)胞內(nèi)的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。

2 重金屬吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)

重金屬離子的吸收和在細(xì)胞中體內(nèi)的平衡是由具體轉(zhuǎn)運(yùn)載體和金屬泵控制［6］，它們都是典型的膜蛋白，屬于不同的植物金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，可以在組織水平(例如從葉肉向表皮細(xì)胞運(yùn)輸金屬離子)或在器官水平(例如從根部向地上部運(yùn)輸金屬離子)起作用。這些蛋白質(zhì)控制金屬離子運(yùn)輸穿過質(zhì)膜、液泡膜，和其他的內(nèi)膜細(xì)胞器等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)［7-8］。像HMAS(重金屬相關(guān)蛋白)和NRAMPs(抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白)這些蛋白是通過基因工程提高重金屬的耐受性的好對象。重要的是，這類蛋白的過表達(dá)既加強(qiáng)植物對重金屬的耐受性，又沒有對植物生理代謝造成不利影響［9-10］。金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能提高植物重金屬耐受性的能力主要源自于它們能增加植物把重金屬封存在液泡中的能力，并且形成重金屬螯合物，從而大大降低了其對植物所造成的毒性。

2.1 鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族(ZIP)ZIP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，優(yōu)先參與鐵和鋅的吸收、富集［11］，也可能參與了對鎘的響應(yīng)［12］和對鎳的耐受性［13］。關(guān)于這個(gè)家族的各個(gè)成員，擬南芥中有3個(gè)IRT(鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)的基因，控制不同的金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)。鋅處理劑量的增加引起IRT1、IRT2和IRT3這3個(gè)基因的表達(dá)，這表明它們可能參與控制細(xì)胞內(nèi)鋅–鐵的平衡。擬南芥、圓葉南芥IRT1和IRT2基因的表達(dá)量與其對重金屬的超富集能力呈負(fù)相關(guān)［14］。有趣的是，這些基因的過表達(dá)不明確能否提高重金屬耐受性。例如，擬南芥IRT1基因的過表達(dá)引起鐵、錳、鈷和鋅大量富集，從而對植株造成不利影響［15］。有趣的是，擬南芥IRT3表達(dá)對鐵和鋅積累的影響不同:鋅在轉(zhuǎn)基因株系的莖葉中富集，而鐵則在根中富集［16］。另一種參與鋅的特異性吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白(ZNT)，在天藍(lán)遏藍(lán)菜中控制鋅的長距離運(yùn)輸［17］。與野生型相比，過表達(dá) NcZNT擬南芥根部富集更多的鋅(而莖、葉富集程度比根弱)。然而，過表達(dá)IRT1基因轉(zhuǎn)基因株系［15］，比野生型更易受到高劑量的鋅毒害［17］。這些研究結(jié)果表明，這類蛋白質(zhì)的表達(dá)必須嚴(yán)格控制，因?yàn)樗鼈兊谋磉_(dá)可能對離子平衡造成負(fù)面影響。

2.2 重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(HMA)來自P1B-ATPase家族HMA參與金屬離子從細(xì)胞質(zhì)穿過細(xì)胞膜，從而使離子從根部向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)［18］。然而，最近的一項(xiàng)研究，使用尺寸排阻色譜法和電感耦合等離子體質(zhì)譜分析表明，AtHMA4還能螯合鋅離子和鎘離子［19］。這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在不同的同源或異源系統(tǒng)中過表達(dá)增加其重金屬耐受性，這意味它們可能有非常重要的生物應(yīng)用價(jià)值。它們的離子特異性表現(xiàn)為廣譜，對鋅、鎘和鈷都有抗性。擬南芥AtHMA4過表達(dá)，其根系在高濃度鋅、鎘和鈷下的生長增強(qiáng)［9］。這一結(jié)果得到在AtHMA4突變植物對鋅和鎘的敏感性增加試驗(yàn)的確證［20］?？梢酝ㄟ^HMAS與金屬硫蛋白共同過表達(dá)來控制其離子特異性和在重金屬耐性中所起的作用。這種方法既增加植物對鎘的耐受性并提高鎘和鋅從根部向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)的能力，又沒有影響對鎘、鋅的吸收和鋅的耐受性［21］。重金屬超富集植物圓葉南芥AhHMA4同族體使其產(chǎn)生對鋅和鎘的耐受性，并且也參與了鋅由根向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)與積累［22］。該基因在番茄根中超表達(dá)能維持鋅–鐵的平衡，因?yàn)槿~中鋅過量加劇了鐵的缺乏，從而激活鐵的吸收［23］。

2.3 陽離子擴(kuò)散促進(jìn)者(CDF)CDF蛋白家族成員的功能是控制鋅、鎘、鈷和鎳的逆向輸送，以定位于液泡膜。AtMTP1是Zn2+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對鋅有高度特異性，依賴V-ATPase將鋅從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中去［24］。AtMTP1超表達(dá)提高擬南芥對鋅的耐受性，而AtMTP1突變體對鋅更加敏感［25］。最近報(bào)道表明，AtMTP1中一段特定的氨基酸序列負(fù)責(zé)其對鋅特異選擇和鋅含量的鑒定。在酵母中將這段特定的序列進(jìn)行點(diǎn)突變就能產(chǎn)生對鈷和鎘的耐受性［26］，這就意味著通過對這個(gè)蛋白進(jìn)行基因工程改造來擴(kuò)大其金屬離子的特異性。擬南芥AtMTP3過表達(dá)使其產(chǎn)生對鋅的耐受性，并促進(jìn)鋅在根和蓮座葉上富集［27］。AtMTP11是定位在液泡前體，與錳的耐受性和富集相關(guān)的蛋白［28］。其他植物物種的CDF家族蛋白，如OsMTP1定位到質(zhì)膜，它們有更廣譜的離子特異性。OsMTP1在酵母中過表達(dá)增加其對鋅、鎳和鎘的耐受性［29］。東南景天SaMTP1在兩種生態(tài)型差異表達(dá)使得它們的重金屬超富集能力不同，這表明了SaMTP1蛋白能提高對重金屬耐受性。不同生態(tài)型SaMTP1表達(dá)差異較大，超富集生態(tài)型SaMTP1表達(dá)的量比其非超富集的生態(tài)型高出80倍［30］。遏藍(lán)菜TgMTP1在擬南芥中表達(dá)時(shí)能讓擬南芥產(chǎn)生對鋅的耐受性，它提高了鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ZIP3、ZIP4、ZIP5和ZIP9)在地上部和根系組織的表達(dá)［31］，這表明它可能是ZIP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族這些成員的一個(gè)上游激活子。

2.4 自然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白(NRAMP)轉(zhuǎn)運(yùn) NRAMP基因家族編碼介導(dǎo)多種金屬轉(zhuǎn)運(yùn)的膜蛋白。通過過表達(dá)的研究表明，AtNRAMP1、AtNRAMP3、AtNRAMP4 和OsNRAMP1(除OsRAMP2和AtRAMP2外)都參與鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)并對過量鐵產(chǎn)生耐受性［10］。有趣的是，它們對鎘耐受性影響剛好相反:在擬南芥中過表達(dá)AtNRAMP3對鎘的敏感性反而增強(qiáng)［32］。此外，AtNRAMP3的過表達(dá)導(dǎo)致AtIRT1表達(dá)量下降，這表明兩者可能競爭控制對鐵的吸收［33］。水稻OsNRAMP1，位于內(nèi)胚層和中柱鞘細(xì)胞的質(zhì)膜上，它參與鐵的吸收，當(dāng)在擬南芥中表達(dá)時(shí)，增加根和莖葉對過量砷和鎘的耐受性［34］。水稻的一個(gè)重要特點(diǎn)是富集高濃度的Mn，這是由位于質(zhì)膜的根特異蛋白NRAMP5控制。除了對錳的影響外，它能促進(jìn)鎘和鐵的富集［35］。

3 金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

轉(zhuǎn)錄因子是提高植物重金屬耐受性非常有效的方法。最近有報(bào)道表明，在受鎘刺激后，擬南芥HMA3、MTP3、IRT2和鐵調(diào)節(jié)基因2(IREG2)的轉(zhuǎn)錄由控制鐵平衡的轉(zhuǎn)錄因子(FIT)AtbHLH38和AtbHLH39所控制。重要的是，這些轉(zhuǎn)錄因子的共同過表達(dá)使擬南芥對鎘的耐受性增強(qiáng)，也誘導(dǎo)煙酰胺合成酶NAS1和NAS2的表達(dá)，這導(dǎo)致具有金屬螯合作用的煙酰胺的合成［36］。其他控制金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，包括與ZIP4相關(guān)的基本區(qū)域亮氨酸拉鏈(bZIP)轉(zhuǎn)錄因子bZIP19和bZIP23［37］。在缺鐵時(shí)，合適的轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)促進(jìn)鐵的吸收(三價(jià)鐵螯合物還原酶FRO2和IRT1)。只有在FIT存在的情況下，這些蛋白質(zhì)才能表達(dá)［38］。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)IT表達(dá)在圓葉南芥中比在擬南芥中弱［14］，這表明超富集的擬南芥與非超富集圓葉南芥在鐵的吸收調(diào)控上可能不同。

4 金屬硫蛋白(MTs)和植物螯合肽(PCs)

金屬硫蛋白是廣泛存在的低分子量、富含半胱氨酸和結(jié)合金屬的蛋白質(zhì)，它對金屬解毒能力非常重要。它們清除活性氧種類(ROS)的能力與它們的作用方式有關(guān)［39］。當(dāng)擬南芥金屬硫蛋白基因AtMT2a和AtMT3在蠶豆中表達(dá)時(shí)，可以保護(hù)保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體免受因鎘的影響而引起的降解。這種影響是由于細(xì)胞中ROS含量變化所造成［40］。白菜金屬硫蛋白BrMT1在擬南芥葉綠體中表達(dá)，能增強(qiáng)抗鎘和氧化脅迫的能力［41］。陸地棉GhMT3a基因轉(zhuǎn)入煙草中表達(dá)的試驗(yàn)表明:金屬硫蛋白控制ROS含量的能力在對其他非生物脅迫的抗性上非常重要［42］。金屬硫蛋白除了對ROS的調(diào)節(jié)，也控制重金屬富集，如水稻OsMT1A過表達(dá)控制鋅的富集［43］，擬南芥種子中特異性AtMT4A過表達(dá)控制銅和鋅的富集。因此金屬硫蛋白的過表達(dá)一般能提高植物重金屬耐性。擬南芥植物過表達(dá)木豆CcMT1更加耐銅和鎘［44］，而大蒜金屬硫蛋白AsMT2b和芋CeMT2b既產(chǎn)生對鎘的耐受性也促進(jìn)其富集［45］。

植物絡(luò)合素是由重金屬誘導(dǎo)合成金屬結(jié)合肽。它們通過巰基螯合重金屬，由此產(chǎn)生的金屬螯合物被隔離到液泡。然而，植物螯合肽合成酶(PCS)基因的過表達(dá)并不總是對重金屬的抗性起有利影響。例如，在水稻中過表達(dá)小麥異源TaPCS1對鎘的敏感性增加，顯著增加莖葉鎘的富集，但根除外［46］。另一方面，擬南芥突變體cad1-3和cad1-6因?yàn)槿狈χ参矧想暮铣擅杆员憩F(xiàn)出明顯的鋅敏感并且根系中鋅富集水平降低［47］。最近對水生植物金魚藻植物PCS的研究表明，該蛋白在煙草［48］或擬南芥［49］中的表達(dá)都能提高植物螯合肽的合成并增強(qiáng)對鎘和砷的富集。轉(zhuǎn)PCS的NnPCS1基因蓮植物，相比野生型提高了對鎘的富集能力［50］。另一個(gè)發(fā)現(xiàn)是潛在的生物相關(guān)性:ATPCS與半胱氨酸脫巰基酶共表達(dá)能促進(jìn)氧硫化物的生產(chǎn)和隨后重金屬在好氧條件下沉淀。這些蛋白共同表達(dá)的植物中比只過表達(dá)一種酶的植株對砷的富集量更大［51］。

5 細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)狀態(tài)和提高植物重金屬抗性

氧化脅迫與植物對重金屬脅迫密切相關(guān)［4］。它是由一個(gè)范圍廣泛的生物和非生物脅迫誘導(dǎo)［52］和由ROS的增加引起的。一方面，ROS是重要信號分子，由于脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生過量的ROS可以對細(xì)胞膜造成不利影響，這可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。大麥暴露在鎘中增加根中過氧化氫和超氧化物含量和降低了羥基自由基的產(chǎn)生。重要的是，ROS的分布也發(fā)生了顯著的變化。這可能引發(fā)沿根軸的某些區(qū)域，發(fā)生特定的防御反應(yīng)，如細(xì)胞壁交聯(lián)和木質(zhì)化［53］。此外，在低鎘濃度下，只在表皮細(xì)胞產(chǎn)生超氧化物。較高濃度的鎘增加根尖伸長區(qū)皮層組織超氧化物的數(shù)量，伴隨著是誘導(dǎo)細(xì)胞死亡［54］。植物暴露于高濃度鎘條件下產(chǎn)生過量的ROS導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，隨后就是細(xì)胞死亡［55］。有趣的是，在這種情況下，細(xì)胞死亡強(qiáng)度和沿根軸的分布依賴于離子［56］。這些結(jié)果表明，增強(qiáng)植物的抗氧化防御反應(yīng)可能有利于重金屬的耐受性。高羊茅中銅或鋅超氧化物歧化酶、抗壞血酸過氧化物酶在氧化脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子SWPA2作用下同時(shí)過表達(dá)，能提升其對鎘、銅和砷的耐受性［57］。然而，氧化脅迫的發(fā)生，導(dǎo)致細(xì)胞有害降解產(chǎn)物的積累，如醛。乙醛脫氫酶基因AthALDH3的過表達(dá)，同樣也提高對銅和鎘的耐受性［58］。

6 展望

重金屬的毒性是一個(gè)嚴(yán)重的環(huán)境問題。暴露于較高濃度重金屬的敏感植物的生長和產(chǎn)量都顯著降低，尤其是主要作物受到這種毒害將產(chǎn)生非常不利的影響。有害重金屬會損傷植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜，并抑制運(yùn)輸和基本代謝的進(jìn)行。其中的一些負(fù)面影響也可能由其他非生物脅迫如干旱和鹽分所造成的。但是，重金屬脅迫也有一些自身獨(dú)特的特征。重金屬的植物耐受性反映了其阻止重金屬的毒害的能力，耐重金屬的植物通過阻止吸收重金屬，在細(xì)胞外的絡(luò)合作用，在細(xì)胞質(zhì)中的絡(luò)合和螯合作用，盡可能地將它們隔離在液泡中等方式來減輕重金屬對其造成的傷害。要達(dá)到這些目標(biāo)，植物必須能激活其防御反應(yīng)，如激活抗氧化酶的表達(dá)、阻止或修復(fù)由于氧化脅迫所造成的二次損害。不同植物利用不同的策略來應(yīng)對重金屬毒性:從敏感到耐受和富集重金屬。目前，主要用兩種生物技術(shù)的方法來減少在自然界中重金屬毒性的影響。一是在某些植物中增強(qiáng)吸收重金屬的能力，這將增加它們對污染地區(qū)的植物修復(fù)效用。二是提高植物抗重金屬毒害，這樣可以防止植物的生長和產(chǎn)量受到抑制。以后應(yīng)努力提高植物耐重金屬的能力，從而減少有害重金屬進(jìn)入食物鏈的范圍。

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