miRNA145作為抑癌基因在胃癌中的表達(dá)及其功能研究

劉 莎，孫國平

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，安徽合肥 230022)

Lee等在1993年第一次在線蟲中證明了miRNA的存在，命名為lin-4，lin-4的目標(biāo)基因為異時性開關(guān)基因let-7，可作用于胚胎的后期時序發(fā)育［1］。miRNA由18～25個核苷酸組成，是一類靶基因為mRNA的3'非編碼區(qū)或編碼區(qū)的內(nèi)源性非編碼的短鏈小分子RNA，通過完全互補(bǔ)(植物中常見)或不完全性互補(bǔ)結(jié)合(哺乳動物中普遍)的方式抑制轉(zhuǎn)錄后蛋白的翻譯［2－3］。具體過程如下:Pri-miRNA 是在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉(zhuǎn)錄生成的，可長達(dá)7 000 nt，然后又被RNaseⅢ Drosha及其輔助因子Pasha迅速切割成約70 nt左右莖環(huán)狀的的Pre-miRNA(其結(jié)構(gòu)與mRNA相似)。初步剪切完成后，PremiRNA、細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)運蛋白Exportin-5、G蛋白因子Ran形成復(fù)合物，由核內(nèi)再轉(zhuǎn)運到胞漿中。在胞漿中，pre-miRNA在Dicer的作用下被切割成長約為22個核苷酸的雙鏈miRNA，成熟miRNA和其互補(bǔ)序列的miRNA形成的雙螺旋解旋后，一條鏈被降解，另外一條成熟的單鏈miRNA保留在RISC(RNA-induced silencing complex)復(fù)合體中，成為成熟的miRNA。最后，復(fù)合體與靶mRNA的位點相結(jié)合參與基因調(diào)控［4］。最近有研究表明，人類基因的1/3可能被miRNA調(diào)控，而且每個miRNA又能作用于幾百個目標(biāo)基因［5］，miRNA無疑是腫瘤的發(fā)生發(fā)展及細(xì)胞的增殖、分化、凋亡方面的關(guān)鍵因素［6］。另外，越來越多的研究表明miRNA在腫瘤中發(fā)揮促癌基因或抑癌基因的作用。

2 miRNA145的起源結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特性

Lagos-Quintana等在小鼠心肌細(xì)胞中第一次發(fā)現(xiàn) miRNA145［7］;隨后，Micheal等在人類結(jié)直腸中再次證實了它的存在［8］。miRNA145 長約4.09 kb，其編碼基因位于第5號染色體長臂3區(qū)2帶(5q32)，具有莖-環(huán)樣結(jié)構(gòu)的前體，經(jīng)過酶切后形成由23個堿基構(gòu)成的成熟的miRNA145。起源于人類中胚層的器官或組織含有更多的miRNA145，它是調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞增殖和分化的關(guān)鍵因素［9－10］。miRNA145定位于血管平滑肌細(xì)胞 VSMC，當(dāng)血管受到損傷時，VSMCs中的miR-145表達(dá)水平很快下調(diào)，調(diào)節(jié)血管的損傷修復(fù)促進(jìn)血管內(nèi)膜的形成［11－12］。miRNA145 與 miRNA143 位于同一個初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上，兩者相距較近(不到2 kb)，且有研究證明miRNA143和miRNA145具有相同的功能及協(xié)同的作用，故以此推斷它們來自同一個初級轉(zhuǎn)錄本［13］。大量試驗表明，miRNA145在多種類型的腫瘤組織中表達(dá)明顯減少，其中包括胃癌［14］、結(jié)直腸癌［15］、食 管 癌［16］、乳 腺 癌［17］、卵 巢 癌［18］、宮 頸癌［19］、前列腺癌［20］、膀胱癌［21］、肺癌［22］、肝癌［23］、胰腺癌［24］、鼻咽癌［25］、骨肉瘤［26］、脂肪肉瘤、尤文肉瘤和白血病等，并且能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖生長、侵襲轉(zhuǎn)移及凋亡等多個環(huán)節(jié)，均提示其發(fā)揮著抑癌基因的作用。miRNA145主要調(diào)控mRNA轉(zhuǎn)錄中和轉(zhuǎn)錄后階段，雙向作用于信號通路［27］。目前發(fā)現(xiàn)的miRNA145在胃癌中的目標(biāo)靶基因有IRS-1、β-actin、N-cadherin和 Ets1;在結(jié)直腸癌中的有FLI1、DFF45和 ERK5;在食管癌中的有 FSCN1;在乳腺癌中的有RTKN和ER-α;在卵巢癌和宮頸癌中的分別是p70S6K1和BCL-2;在前列腺癌中的有ERK5、KRAS和FSCN1;在膀胱癌中的有COX-2和FSCN1;在肺癌中的有c-Myc;在肝癌中的有MUC1;在骨肉瘤中的有VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)等。

3 miRNA145與胃癌細(xì)胞增殖、生長的關(guān)系

胃癌是全球最常見的四大惡性腫瘤之一，并且是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡率高的原因之一［28］。在全球范圍內(nèi)，胃癌發(fā)病率在男性惡性腫瘤中僅次于肺癌，占第二位，在女性惡性腫瘤中居第4位。2008年，全世界大約有989 000例胃癌的新病例和738 000與之相關(guān)的死亡人數(shù)，每年超過70%的病例(約714 000例)發(fā)生在發(fā)展中國家，并且大約50%的胃癌發(fā)生在亞洲的東部［29］。我國是胃癌的高發(fā)國家，且胃癌在我國的各種惡性腫瘤中居首位。男性胃癌的發(fā)病率和死亡率均高于女性，男女之比約為2∶1，發(fā)病年齡以中老年居多(55～70歲高發(fā))，平均死亡年齡為61.6歲。胃癌的病因目前尚未完全清楚，可能與地域環(huán)境、飲食生活因素、化學(xué)因素、幽門螺桿菌感染、癌前疾病(如慢性萎縮性胃炎、胃潰瘍、胃息肉、殘胃炎等)和癌前病變(腸型化生和異型增生)、遺傳基因因素等有關(guān)。

經(jīng)研究表明，胃癌經(jīng)常伴有多種miRNA的異常表達(dá)，尋找特異性miRNA對于胃癌的診治有著重要的意義。Takagi等的研究顯示，miRNA145在人胃癌樣本中表達(dá)下調(diào)，并且通過轉(zhuǎn)染方式過表達(dá)miRNA145可以抑制體外胃癌MKN-1和KATO-III細(xì)胞系的增殖和生長［30］，有關(guān)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)還表明，IRS-1的3'-UTR和 β-actin基因中的某個區(qū)域與miRNA145中的目標(biāo)種子區(qū)是完全互補(bǔ)的，因此推斷IRS-1和β-actin是影響胃癌細(xì)胞增殖和生長的可能候選靶基因［31］。另外，Gao等的研究表明，miRNA145 在BGC-823，SGC-7901，MKN-45，MKN-28四個胃癌細(xì)胞系并沒有影響細(xì)胞生長和增殖;同時Spearman等人的相關(guān)試驗表明，miRNA145的表達(dá)水平在人類胃癌樣本中與腫瘤大小之間沒有相關(guān)性。不同研究結(jié)果的差異性最可能來源于miRNA作用的細(xì)胞和組織特異性［32］。但是目前，已有報道稱大多數(shù)miRNA在發(fā)起或抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的同時可能影響細(xì)胞的生長，細(xì)胞生長也會影響到轉(zhuǎn)移的過程［33－35］，更深層次的機(jī)制還需要進(jìn)一步的探索。

4 miRNA145與胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系

4.1 miRNA145與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系 惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移往往導(dǎo)致癌癥的相關(guān)死亡［36］。Tchernitsa等通過芯片以及RT-PCR方法檢測20例胃癌患者標(biāo)本，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤與非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組織中，miRNA145表達(dá)存在顯著差異，提示miRNA145與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)［37］。同時，在Gao等的研究中，miRNA145在胃癌組織中的表達(dá)水平比相應(yīng)非腫瘤組織低32.35倍，體外試驗中 miRNA145的異常表達(dá)和功能喪失表明其能夠抑制侵襲和轉(zhuǎn)移，并可能作為轉(zhuǎn)移抑制基因，體內(nèi)自發(fā)轉(zhuǎn)移試驗分析進(jìn)一步證實了其抑制侵襲的功能，包括阻止胃癌的局部侵犯及抑制血液轉(zhuǎn)移［32］。

4.2 miRNA作用于胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制 N-cadherin是一種增加侵襲潛能的鈣依賴性的細(xì)胞黏附分子［37］。在Gao等的這項研究中，熒光素酶測定和免疫印跡均顯示N-cadherin是miRNA145的直接靶基因，實驗還表明，當(dāng)miRNA145表達(dá)細(xì)胞重新表達(dá)N-cadherin時，其入侵缺陷被逆轉(zhuǎn)，而使用miRNA145抑制劑抑制miRNA145的表達(dá)的細(xì)胞則導(dǎo)致N-cadherin的上調(diào)，當(dāng)上調(diào)N-cadherin的基因被進(jìn)一步沉默，細(xì)胞的遷移和入侵活動也受到相應(yīng)的抑制［38］。還有研究發(fā)現(xiàn)，MMP9也同時參與胃癌的轉(zhuǎn)移，MMP9的增加可賦予胃癌細(xì)胞更大的穿透基質(zhì)的能力，從而促進(jìn)腫瘤侵襲［39］。Gao等通過觀察MMP9在轉(zhuǎn)染N-cadherin細(xì)胞和N-cadherin沉默細(xì)胞中的表達(dá)差異，推斷MMP9可能是miRNA145的下游靶基因，miRNA145通過作用于N-cadherin的表達(dá)間接下調(diào)MMP9，從而達(dá)到抑制胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力。

此外，Zheng等還發(fā)現(xiàn)miRNA145另外一個直接作用的靶基因Ets1。研究發(fā)現(xiàn)Ets1在胃癌組織高度表達(dá)，并且與胃癌細(xì)胞的入侵和轉(zhuǎn)移等惡性潛能相關(guān)，miRNA145通過在轉(zhuǎn)錄后水平直接作用于Ets1的3＇-UTR區(qū)域而抑制其表達(dá)，從而阻止了胃癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成［40］，Ets1進(jìn)一步調(diào)節(jié)多個基因的表達(dá)，如MMP1、MMP9，u-PA，從而達(dá)成抑制細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)、侵襲和轉(zhuǎn)移的目的［41］。

5 miRNA145與胃癌早期發(fā)現(xiàn)、治療及預(yù)后的關(guān)系

胃癌病因未明，臨床癥狀無特異性，確診需依賴胃鏡檢查加活檢，難以早期發(fā)現(xiàn)，但其預(yù)后卻直接與診斷時的分期相關(guān)。由于miRNA145在癌前病變組織中表達(dá)下降，且通過簡易的采血方式獲得的血清中含有用于檢測的足量的miRNAs，故其可作為早期診斷胃癌的生物學(xué)標(biāo)志。

另外，腫瘤組織中miRNA145的表達(dá)量在很大程度上決定了放化療療效及預(yù)后。Homano等發(fā)現(xiàn)胃癌患者中miRNA145含量低者對順鉑化療容易耐藥，且術(shù)后總生存率降低，通過恢復(fù)miRNA145的功能可使耐藥細(xì)胞重新對順鉑敏感［42］，同時Takeshi Takagi等研究還發(fā)現(xiàn)通過轉(zhuǎn)染miRNA145也可以增加胃癌細(xì)胞對于5-氟尿嘧啶的敏感性［30］。

近期，Ibrahim等建立了一個miRNA替代療法，在活體小鼠結(jié)腸癌模型中運用聚乙烯亞胺(PEI)介導(dǎo)的工具載入miRNA145，全身和局部應(yīng)用低分子量PEI/miR145復(fù)合物后，完整的miRNA145被運輸至小鼠腫瘤部位，引起了抗腫瘤效應(yīng)。證實了miRNA145可以有效到達(dá)腫瘤部位發(fā)揮抑癌基因的作用，也預(yù)示著miRNA145基因替代治療胃癌的可實現(xiàn)性［43］。

6 展望

miRNA145作為胃癌抑癌基因的特征表明，它將成為胃癌治療中的新的突破點。相信在不久的將來，miRNA145可以更多地應(yīng)用于幫助臨床醫(yī)師確定多種惡性腫瘤組織的起源、評價預(yù)后及指導(dǎo)治療，真正實現(xiàn)其臨床價值。

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