基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的大菱鲆(Scophthalmus maximus)SNP標(biāo)記開發(fā)及多態(tài)性分析*

王 婷 黃智慧 馬愛軍① 馬得友 王新安 夏丹丹 馬本賀

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島市海水魚類種子工程與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071; 2. 大連海洋大學(xué) 大連 116023)

大菱鲆(Scophthalmus maximus)屬于鰈形目、鲆科、菱鲆屬, 在我國(guó)俗稱“多寶魚”。原產(chǎn)于歐洲大西洋東北部, 20世紀(jì)70年代, 英國(guó)首度成功開發(fā)了大菱鲆人工養(yǎng)殖技術(shù), 于1992年引入我國(guó), 目前已成為我國(guó)北方沿海工廠化養(yǎng)殖業(yè)的主導(dǎo)品種之一(雷霽霖等, 2002)。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大, 集約化程度的不斷提高, 大菱鲆疾病頻發(fā)、養(yǎng)殖周期長(zhǎng)、養(yǎng)殖成本上升等嚴(yán)重制約了我國(guó)大菱鲆的養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展(雷霽霖等, 2012)。因此, 對(duì)大菱鲆進(jìn)行遺傳改良、選育新品種已成為提高養(yǎng)殖效益和健康化養(yǎng)殖水平的當(dāng)務(wù)之急。

大規(guī)模發(fā)掘大菱鲆分子標(biāo)記, 是儲(chǔ)備種質(zhì)資源、構(gòu)建性狀相關(guān)遺傳解析、開發(fā)分子遺傳育種技術(shù)的基礎(chǔ)工作。單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(single nucleotide polymorphism, SNP)是美國(guó)學(xué)者Lander于1996年提出的第三代DNA遺傳標(biāo)記(Lander, 1996)。由于SNP數(shù)目多、覆蓋密度大(Sachidanandamet al, 2001), 具有遺傳穩(wěn)定性和代表性(Collinset al, 1997), 便于高通量自動(dòng)化檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn), 已經(jīng)廣泛應(yīng)用在構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、關(guān)聯(lián)分析、分子輔助育種、群體遺傳系統(tǒng)、品種鑒定等方面, 并表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景(Liuet al, 2004)。在水產(chǎn)動(dòng)物中, SNP的開發(fā)和應(yīng)用已經(jīng)有若干報(bào)道, 如鯰魚(Kucuktaset al, 2009)、櫛孔扇貝(Jianget al, 2011)、蟹(Maet al, 2011)、蝦夷扇貝(Liuet al, 2011)、對(duì)蝦(吳瑩瑩等, 2013)等。在大菱鲆中也有部分開發(fā)和應(yīng)用(劉慶明等, 2012; Navajaset al, 2012; Veraet al, 2013), 但數(shù)量還未達(dá)到構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜的要求。

目前大規(guī)模SNP位點(diǎn)信息的獲得主要是通過(guò)基因組測(cè)序, 伴隨序列拼接比對(duì)而產(chǎn)生, 但是這種方法成本較高。對(duì)于沒有基因組信息的非模式生物, 多利用已知的EST序列自行篩選, 但是EST序列與實(shí)際序列有一定差異, 所以這種方法前期準(zhǔn)備工作比較艱巨, 開發(fā)效率比較低, 覆蓋率不夠廣, 目的性不夠強(qiáng)(Liuet al, 2006; 劉慶明等, 2012)。目前大菱鲆已知的EST序列只有15641個(gè), 使得該物種SNP篩選工作難度更高; 隨著第二代測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展, 高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序成本大幅降低, 為解決這些難題提供了契機(jī)。通過(guò)新一代高通量測(cè)序技術(shù), 能夠全面快速地獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本及基因序列, 并且可以準(zhǔn)確檢測(cè)出高度復(fù)雜的序列, 通過(guò)一系列對(duì)比識(shí)別大量的SNP位點(diǎn)(Zhouet al, 2010)。本研究首次利用大菱鲆雌雄高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序信息, 去冗余后得到71107 contig,為大菱鲆的SNP標(biāo)記大規(guī)模開發(fā)提供了豐富的序列資源和位點(diǎn)信息, 而且為進(jìn)一步的QTL定位、性別控制等研究帶來(lái)了極大便利。

迄今已經(jīng)有很多種檢測(cè)開發(fā)SNP多態(tài)性的技術(shù)方法, 如基于雜交的基因芯片技術(shù)(Gene chips)(Wanget al, 1998)、探針技術(shù)(TaqMan) (Martinsohnet al, 2009), 基于核酸構(gòu)象的單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Singlestrand conformational polymorphism, SSCP) (Heet al,2008)等。雖然方法很多, 但是存在著開發(fā)量低、消耗時(shí)間多、操作步驟冗長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)費(fèi)用昂貴、適用范圍有限等問(wèn)題, 限制了SNP標(biāo)記的利用和推廣。高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(High Resolution Melting, HRM),是近年來(lái)興起的一種SNP檢測(cè)的新手段, 可以迅速的檢測(cè)出DNA片段中堿基的突變(Liet al, 2012); 因其操作簡(jiǎn)便快速, 結(jié)果準(zhǔn)確效率高, 費(fèi)用成本低, 并且實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作, 已受到廣泛的關(guān)注(羅文龍等, 2011)。另外, HRM的小片段法特異性好, 避開了探針設(shè)計(jì)的誤差和不對(duì)稱PCR的復(fù)雜操作, 降低了開發(fā)成本, 提高了開發(fā)效率(Liewet al, 2004)。本研究在大菱鲆轉(zhuǎn)錄組Solexa高通量測(cè)序數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上,根據(jù)預(yù)測(cè)的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物, 通過(guò)小片段HRM分型技術(shù), 成功開發(fā)了大菱鲆EST-SNP標(biāo)記21個(gè), 為大菱鲆遺傳圖譜構(gòu)建、性狀相關(guān)QTL定位和分子遺傳育種提供了候選標(biāo)記資源。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用大菱鲆來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室在煙臺(tái)天源水產(chǎn)國(guó)家級(jí)良種場(chǎng)所構(gòu)建的家系(馬愛軍等, 2012), 共96尾魚,樣品詳細(xì)資料見表1。DNA取樣品尾鰭, 使用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取, 用超微量紫外分光光度計(jì)定量, 稀釋至40ng/μL, –20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 大菱鲆SNP標(biāo)記開發(fā)樣品信息Tab.1 Sample information of turbot for SNP in S. maximus

1.2 SNP位點(diǎn)的查找和小片段法引物設(shè)計(jì)

大菱鲆轉(zhuǎn)錄組Solexa高通量測(cè)序、contig的拼裝和SNP位點(diǎn)的預(yù)測(cè)由國(guó)家人類基因組南方研究中心完成。根據(jù)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果, 查找覆蓋度大于500的候選SNP位點(diǎn), 共得到147個(gè)位點(diǎn)。

利用Primer5.0對(duì)每一個(gè)候選位點(diǎn)設(shè)計(jì)一組引物,要求引物長(zhǎng)度20bp左右, GC含量為45%—65%, 產(chǎn)物長(zhǎng)度小于80bp; 利用Oligo7.0分析引物參數(shù), 不能有能值高的錯(cuò)配、二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)。高低溫內(nèi)標(biāo)為兩段長(zhǎng)度50bp的DNA片段, 提供獨(dú)立于PCR產(chǎn)物的大約68°C和88°C的熔解曲線。分別為5-ATCGTG ATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTTGGCATTAATAA TTTCATTTT-3’和5’-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGG TAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3’及各自的反向互補(bǔ)序列(Seippet al, 2007)。引物和內(nèi)標(biāo)由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 PCR引物驗(yàn)證和HRM小片段法分型

以8個(gè)群體, 每個(gè)群體6個(gè)個(gè)體DNA等量混合作為模板DNA, 進(jìn)行引物檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為10μL: 40 ng/μLDNA模板1μL, 2×ES Taq Master Mix 4.5μL, 上游引物(10μmol/L) 0.5μL; 下游引物(10μmol/L) 0.5μL,ddH2O 3.5μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)? 95°C預(yù)變性5min;94°C變性30 s, 退火溫度(視具體引物Tm值而定)退火30s, 72°C延伸30s, 共35個(gè)循環(huán); 最后72°C延伸7min, 4°C保存。用含Genefinder染料的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

根據(jù)電泳結(jié)果, 選擇目的條帶清晰單一的位點(diǎn)進(jìn)行高低溫內(nèi)標(biāo)雜交并加入LC Green Plus染料。每個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入染料1.0μL, 高溫內(nèi)標(biāo)和低溫內(nèi)標(biāo)的正負(fù)向引物各加0.25μL, 95°C變性5min后,降溫至4°C保存。

使用LightScanner儀器進(jìn)行HRM分型, 要求以0.1°C/s的速度, 從56°C快速升溫到97°C, 以1/s的密度采集熒光信號(hào), 得到高分辨率溶解曲線。結(jié)束后用 LightScanner配套軟件對(duì)采集曲線進(jìn)行基因分型。

1.4 遺傳多態(tài)性檢測(cè)

SNP位點(diǎn)的分型結(jié)果采用POPGEN32 (version 1.32)軟件處理, 純合子分別記為AA和BB, 雜合子記為AB, 統(tǒng)計(jì)各位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)(Effective number of alleles,Ne), 期望雜合度(Expected heterozygosity,He),觀測(cè)雜合度(Observed heterozygosity,Ho), 統(tǒng)計(jì)各位點(diǎn)基因型分布及其頻率和最小等位基因頻率(Minor allele frequency, MAF)。用PIC_CALC(0.6)計(jì)算各位點(diǎn)多態(tài)信息含量(Polymorphism information content,PIC)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 引物驗(yàn)證和小片段HRM分型

本課題組高通量測(cè)序系統(tǒng)大規(guī)模測(cè)序的結(jié)果共獲得8642個(gè)SNP位點(diǎn), 轉(zhuǎn)換顛換比為1.3。在覆蓋度大于500的SNP位點(diǎn)中, 根據(jù)兩側(cè)序列特點(diǎn), 選取45個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物63組, 經(jīng)過(guò)PCR體系條件優(yōu)化, 設(shè)置最佳的Tm值, 利用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),有21對(duì)引物產(chǎn)生大小符合預(yù)期的單一條帶。其中部分SNP位點(diǎn)的詳細(xì)信息見表2。對(duì)擴(kuò)增出目的條帶的位點(diǎn), 用8個(gè)群體96個(gè)個(gè)體進(jìn)行重新PCR, 變性, 經(jīng)過(guò)小片段HRM (LightScanner)驗(yàn)證, 21個(gè)位點(diǎn)均能明顯區(qū)分不同基因型。一共有11個(gè)顛換, 10個(gè)轉(zhuǎn)換, 其中C/T和G/A最常見(圖1)。

表2 部分SNP位點(diǎn)信息Tab.2 Detailed information of part of the SNP loci in S.maximus

圖1 SNP突變類型分布Fig.1 Distribution of SNP variants

圖2a所示為位點(diǎn)S3的小片段HRM分型圖, 是轉(zhuǎn)換, 其中紅色曲線為純合峰, 峰值較低,Tm約78.7°C,是T/T型; 藍(lán)色曲線為純合峰, 峰值較高,Tm值79.4°C, 是C/C型; 灰色為雜合峰, 是T/C型。圖2b所示為位點(diǎn)S16的小片段HRM分型圖, 是顛換, 其中紅色曲線為純合峰, 峰值較高,Tm約80.7°C, 是T/T型; 藍(lán)色曲線為純合峰, 峰值較低,Tm值80.1°C,是A/A型; 灰色為雜合峰, 是A/T型。

2.2 SNP位點(diǎn)多態(tài)性分析

所得的基因型數(shù)據(jù)利用POPGEN32(version 1.32)統(tǒng)計(jì)分析, 結(jié)果顯示21個(gè)SNP位點(diǎn)均含有兩個(gè)單倍體(表3); 觀測(cè)雜合度Ho的分布范圍為0.256—1.000,期望雜合度He的范圍從為0.276—0.518。有效等位基因數(shù)Ne分布范圍1.352—2.051。最小等位基因頻率MAF分布范圍0.0426—0.5000。多態(tài)信息含量分析顯示21個(gè)位點(diǎn)的PIC值范圍為0.226—0.446, 其中2個(gè)位點(diǎn)(CS5, S7)屬于低度多態(tài)(PIC<0.25), 其余19個(gè)位點(diǎn)屬于中度多態(tài)(0.25

2.3 SNP位點(diǎn)序列的功能分析

利用NCBI的BlastP, 對(duì)成功篩查到的21個(gè)多態(tài)SNP位點(diǎn)所在的contig序列進(jìn)行功能注釋, 21個(gè)SNP位點(diǎn)所在的20個(gè)contig均有明確有效功能注釋, 涉及細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞骨架、能量轉(zhuǎn)換及RNA的加工修飾等(表4)。

利用ORF finder推測(cè)出開發(fā)閱讀框, 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì), 確保ORF選擇的正確性, 并確定SNP位點(diǎn)在遺傳密碼子的位置, 與標(biāo)準(zhǔn)密碼子比對(duì)發(fā)現(xiàn)CS1位于5’UTR區(qū), S11、S15、S16、S42、S3、CS10位于3’UTR區(qū); 而CS5、S7位于密碼子的首位, CS9位于密碼子第三位, 造成了編碼氨基酸的改變, 為錯(cuò)義突變。其余11個(gè)位點(diǎn)都在密碼子第三位, 為同義突變(表5)。

圖2 SNP位點(diǎn)小片段HRM分型結(jié)果Fig.2 Genotyping result using HRM with small amplicon

3 討論

SNP標(biāo)記的興起, 極大地促進(jìn)了遺傳學(xué)和育種繁殖學(xué)的微觀發(fā)展和深度發(fā)掘。然而, 開發(fā)和檢測(cè)SNP是最關(guān)鍵的兩個(gè)技術(shù)難點(diǎn), 也限制了SNP標(biāo)記在非模式生物(特別是水產(chǎn)動(dòng)物)中的開發(fā)和利用。目前,SNP標(biāo)記的大規(guī)模開發(fā), 一般是利用基因組測(cè)序獲得的序列結(jié)果進(jìn)行對(duì)比推測(cè), 這種途徑比較昂貴(莊偉, 2010); 或者利用EST序列, 但是由于序列誤差的存在, 增加了驗(yàn)證的難度(劉慶明等, 2012)。高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的推廣很好地彌補(bǔ)了這兩種途徑的缺陷(周華等, 2012), 得到的大量EST序列既可以提供相對(duì)更準(zhǔn)確的序列信息, 又降低了成本。本研究利用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)獲得大量EST-SNP位點(diǎn), 經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析, 篩選出4314個(gè)覆蓋度大于10的候選SNP位點(diǎn), 明確了其基因功能。數(shù)量低于其它水產(chǎn)動(dòng)物, 除物種差別, 另外可能的原因是篩查條件較為嚴(yán)格(Maet al, 2011; Veraet al, 2011)。

表3 大菱鲆21個(gè)SNP位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性Tab.3 Genetic variability at 21 SNPs in S. maximus

表4 20個(gè)序列預(yù)測(cè)蛋白的基因注釋信息Tab.4 Gene annotation of 20 predicted proteins

表5 SNP位點(diǎn)的氨基酸突變Tab.5 Amino acid mutations of SNPs

由于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的樣本是大菱鲆mRNA, 有一定的剪切和編輯, 本研究選取的45個(gè)SNP位點(diǎn)中有5個(gè)位點(diǎn)(11%)的PCR產(chǎn)物大于預(yù)期, 推測(cè)可能是由于內(nèi)含子的存在而造成的。但是此數(shù)據(jù)遠(yuǎn)小于使用其它方法的比例(李紀(jì)勤等, 2013), 原因應(yīng)是本研究使用的是小片段法HRM, 設(shè)計(jì)引物時(shí), 使目的片段盡可能地小, 有效避免了內(nèi)含子的出現(xiàn)。另外有4個(gè)位點(diǎn),有可觀的多態(tài)性, 但是沒有準(zhǔn)確的分型結(jié)果, 因?yàn)楫a(chǎn)物溶解峰與高溫內(nèi)標(biāo)溶解峰有部分重疊。要解決這個(gè)問(wèn)題, 需要溶解溫度更高的高溫內(nèi)標(biāo), 或者重新設(shè)計(jì)引物以期得到溶解溫度更低的目的片段。

本研究采用高分辨率溶解曲線(HRM)技術(shù), 并探索了小片段法分型技術(shù), 通過(guò)該方法可以有效避免在同一個(gè)目標(biāo)產(chǎn)物中存在2個(gè)以上SNP位點(diǎn)的可能性, 減少了內(nèi)含子的影響, 從而提高分型效率, 大幅度降低了SNP標(biāo)記開發(fā)的成本。本研究對(duì)45對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)、驗(yàn)證、基因分型、多態(tài)性分析最終獲得21個(gè)SNP標(biāo)記可用于大菱鲆的遺傳和育種研究, 成功率達(dá)到46.7%, 遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非標(biāo)記探針?lè)?劉慶明等, 2012; 吳瑩瑩等, 2013)。

對(duì)獲得的21個(gè)SNP標(biāo)記, 在群體中進(jìn)行遺傳多態(tài)性驗(yàn)證, 多態(tài)信息(PIC)含量分析顯示所有位點(diǎn)均具有多態(tài)性, 19個(gè)為中等多態(tài)。觀測(cè)雜合度的分布范圍為0.256到1.000, 期望雜合度的平均值為0.451,由于SNP標(biāo)記為雙等位形式, 每個(gè)位點(diǎn)所攜帶的多態(tài)信息較少, 因此略小于大菱鲆的其它分子標(biāo)記(Houet al, 2011; Veraet al, 2013)。另外有兩個(gè)偏離了Hardy-Weinberg平衡, 說(shuō)明樣本群體可能有過(guò)遷徙漂變等。

利用EST數(shù)據(jù)庫(kù)開發(fā)SNP標(biāo)記, 有一個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn), 即標(biāo)記位點(diǎn)來(lái)自編碼序列(Coding Sequences,CDS), 與功能基因直接相關(guān), 為進(jìn)一步的功能基因研究提供依據(jù)。本研究獲得3個(gè)非同義cSNP (nonsynonymous cSNP), 即堿基序列的改變可使以其為藍(lán)本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變, 從而影響了蛋白質(zhì)的功能(劉越等, 2008)。另外, 有7個(gè)位于基因的UTL區(qū),可能與基因的表達(dá)調(diào)控相關(guān)(Veraet al, 2011, 2013),后續(xù)基因功能表達(dá)途徑等跟進(jìn)研究中。

總之, 對(duì)于大菱鲆這種沒有基因組數(shù)據(jù)的非模式生物, 應(yīng)用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果, 對(duì)比EST序列, 使用小片段HRM技術(shù), 可以實(shí)現(xiàn)高效率大規(guī)模SNP標(biāo)記的開發(fā), 而且開發(fā)位點(diǎn)與功能基因表達(dá)途徑直接相關(guān), 為進(jìn)一步的遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、經(jīng)濟(jì)性狀的QTL定位以及分子標(biāo)記輔助育種提供更多的標(biāo)記基礎(chǔ)。

致謝 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所張國(guó)范研究員課題組在實(shí)驗(yàn)儀器方面提供了幫助, 謹(jǐn)致謝忱。

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