水生動(dòng)物雙RNA病毒的研究進(jìn)展

葛均青， 龔 暉， 陳 超(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所， 福建 福州 350003)

水生動(dòng)物雙RNA病毒(Aquabirnavirus，ABV)隸屬雙RNA病毒科Birnaviridae，病毒粒子呈二十面 體球形對(duì)稱(chēng)，直徑約60nm，無(wú)囊膜。傳染性胰腺壞死病毒(Infectious Pancreatic Necrosis Virus，IPNV)是ABV的代表種，由Wolf等在1960年首次從河鱒病魚(yú)中分離，可引起多種水產(chǎn)動(dòng)物爆發(fā)急性傳染性疾病，其流行范圍遍及亞、歐、美各國(guó)，導(dǎo)致了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重大經(jīng)濟(jì)損失。IPNV也是我國(guó)口岸魚(yú)類(lèi)病害的第一類(lèi)檢疫對(duì)象(張奇亞和桂建芳，2008)。ABV的功能基因、診斷檢測(cè)及其免疫預(yù)防等一直是國(guó)際上魚(yú)類(lèi)病毒病研究的熱點(diǎn)，Dobos and Roberts(1983)和Bernard and Bremont(1995)曾分別就IPNV的分子生物學(xué)的研究作了綜述。而我國(guó)也開(kāi)展了包括IPNV、海洋雙RNA病毒(Marine Birnavirus,MABV)等的分離、鑒定、基因的表達(dá)(林建國(guó)，2006;徐海君等，2006;趙麗麗等，2010;胡曉利等，2012;王健楠等，2012)等研究工作。本文結(jié)合IPNV及MABV的最新研究進(jìn)展，對(duì)ABV的功能基因、檢測(cè)及免疫防治等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 ABV的復(fù)制

ABV的基因組以負(fù)鏈RNA為模板進(jìn)行基因組復(fù)制(Cortez-San Martinetal.,2009)，編碼5種成熟的蛋白，在病毒的侵染過(guò)程中，還形成多種蛋白前體；IPNV在感染細(xì)胞后6 h，編碼蛋白的合成量增加，在 6-9 h達(dá)到最高峰，隨后減少。IPNV在感染宿主細(xì)胞8-10 h后，病毒RNA的合成量達(dá)到最大，在感染細(xì)胞14 h后，RNA合成量減少。病毒的組裝過(guò)程中，IPNV首先被包裝成病毒前體，通過(guò)進(jìn)一步裂解成為成熟的病毒粒子。ABV需要在低溫條件下才能繁殖，這是因?yàn)椴《镜慕M裝形成與溫度有關(guān)。如IPNV在28 ℃以下才能在細(xì)胞中繁殖。IPNV能夠進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，但是不能復(fù)制(Orpetveitetal.,2012)。

2 ABV的編碼蛋白

ABV的基因組由線性雙股、雙節(jié)段的RNA組成，片段A 編碼一個(gè)大的多聚蛋白，包括VP2、VP3、VP4、VP5，并通過(guò)間隔的ORF編碼一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白VP5；片段B編碼一個(gè)依賴(lài)于RNA的RNA聚合酶。

2.1 VP1蛋白

VP1基因編碼一個(gè)94kD的蛋白，具有RNA聚合酶活性，與病毒RNA轉(zhuǎn)錄和基因組復(fù)制有關(guān)(Grahametal.,2011)。VP1可與病毒基因組通過(guò)共價(jià)鍵牢固結(jié)合，形成復(fù)合體，介導(dǎo)基因組的復(fù)制。

2.2 VP2蛋白

VP2是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在與宿主細(xì)胞膜受體的互作及進(jìn)入細(xì)胞方面發(fā)揮重要作用(Coulibalyetal.,2010)。IPNV的Sp型VP2的Thr217和Ala221決定了IPNV的毒力(Songetal.,2005)。VP2含有與誘導(dǎo)病毒中和抗體有關(guān)的抗原決定簇，因此它經(jīng)常用于不同種或者新分離病毒的疫苗設(shè)計(jì)、診斷和血清型分類(lèi)。

2.3 VP3蛋白

VP3是ABV主要的病毒粒子裝配者(Pedersenetal.,2007)，VP3可與VP1結(jié)合且具有強(qiáng)的自我結(jié)合能力，且VP3的自我互作功能域在N末端，而與VP1的互作結(jié)構(gòu)域在C末端；另外，VP3可以特異性結(jié)合dsRNA，而且C末端在dsRNA的結(jié)合能力方面發(fā)揮關(guān)鍵作用；動(dòng)力學(xué)分析表明VP1-VP3復(fù)合物的存在優(yōu)先于形成成熟的病毒粒子，這表明其可能在裝配過(guò)程中發(fā)揮重要作用(Baharetal.,2013)。另外，VP3可通過(guò)上調(diào)Bad的表達(dá)及破壞線粒體并激活下游caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(Chiuetal.,2010)。

2.4 VP4蛋白

VP4是ABV的非結(jié)構(gòu)蛋白(Nonstructural Polypeptide,NS)，具蛋白酶活性。在它的作用下，將片段A編碼的多聚蛋白NH(2)-pVP2-VP4-VP3-COOH剪切加工為pVP2和VP3，pVP2進(jìn)一步剪切為核衣殼蛋白VP2。結(jié)晶結(jié)構(gòu)分析表明，VP4的裂解位點(diǎn)形成Ser/Lys二聯(lián)體?；鞍酌笍?fù)合物(Leeetal.,2007)。

2.5 VP5蛋白

VP5是Bcl-2家族的抗凋亡基因，可調(diào)控Mcl-1和病毒蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)感病細(xì)胞產(chǎn)生非典型性細(xì)胞凋亡(Hongetal.,2002)。VP5不是病毒在體內(nèi)復(fù)制所必需的，VP5的缺失并不改變病毒的毒力及在宿主上建立持續(xù)穩(wěn)定的侵染(Santietal.,2005)。

3 ABV的侵染機(jī)制

ABV具有很廣的宿主域，可以侵染多種物種。IPNV可以特異性地與CHSE-214，SHK-1和ASK細(xì)胞膜上一個(gè)大約220 kDa的膜蛋白結(jié)合，然而與非鮭魚(yú)細(xì)胞株BF-2細(xì)胞膜上的結(jié)合的蛋白大小約190 kDa(Orpetveitetal.,2008)。流式細(xì)胞試驗(yàn)可以直接檢測(cè)到IPNV的結(jié)合和侵染，在IPNV單獨(dú)或與IHNV共同感染宿主細(xì)胞時(shí)，IPNV可以結(jié)合88%的細(xì)胞，然而IHNV在其它病毒存在時(shí)，其結(jié)合效率總是較低，但是VHSV的結(jié)合不受影響。對(duì)宿主進(jìn)行抗病毒藥物的處理，不影響IPNV和VHSV對(duì)細(xì)胞的結(jié)合，但是降低了IHNV的結(jié)合。IPNV可以進(jìn)入通過(guò)受體介導(dǎo)的途徑進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，但是不能復(fù)制(Orpetveitetal.,2012)。當(dāng)IHNV、VHSV和IPNV同時(shí)感染宿主細(xì)胞時(shí)，其效率明顯低于IPNV(de las Herasetal.,2008)。Mx蛋白對(duì)IPNV有抗病毒作用，其表達(dá)可以明顯降低IPNV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，抑制病毒蛋白的合成(Larsenetal.,2004)。IPNV通過(guò)調(diào)控大西洋鮭魚(yú)炎癥因子的表達(dá)建立持續(xù)感染(Reyes-Cerpaetal.,2012)，而疾病的爆發(fā)和死亡率取決于宿主的防御與信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)調(diào)控和病毒基因組特性間的微妙平衡(Skjesoletal.,2011)。

4 ABV的診斷

ABV引起魚(yú)類(lèi)致病性感染或者潛伏在魚(yú)體內(nèi)、發(fā)病期間流行性傳染，最終導(dǎo)致漁業(yè)生產(chǎn)的重大損失。ABV的檢測(cè)方法有多種，而提高靈敏度和去除假陽(yáng)性是檢測(cè)方法發(fā)展的趨勢(shì)。免疫學(xué)檢測(cè)是應(yīng)用較早的IPNV檢測(cè)方法。但是，IPNV抗體檢測(cè)常缺乏實(shí)際意義，一方面由于曾經(jīng)感染IPNV的虹鱒血清內(nèi)的抗體可持續(xù)數(shù)年，另一方面IPNV攜帶者不含或只含滴度很低的抗體。此外，正常虹鱒血清中還存在非特異的抗病毒成分，所以大多數(shù)情況下難以判斷抗體的水平及其意義。近年來(lái)，開(kāi)展的基于RT-PCR的檢測(cè)方法，為IPNV 的檢測(cè)和疫情監(jiān)測(cè)提供了可靠依據(jù)，如RT-PCR-ELISA(Milneetal.,2006)，定量RT-PCR(Bowersetal.,2008;Liuetal.,2008)和RT-LAMP(Solimanetal.,2009)等。

5 ABV的危害

IPNV可感染多種魚(yú)類(lèi)、牡蠣等淡水和海水水生動(dòng)物，以進(jìn)行垂直傳播和水平傳播。苗期及在環(huán)境脅迫條件下容易發(fā)病，并引起10%-90%的死亡率(Ronnesethetal.,2013)。病毒感染除可直接導(dǎo)致較高的死亡率外，還可以引起免疫抑制，使得容易感染其它病原(Johansen and Sommer,2001)。染病后存活的魚(yú)類(lèi)成為無(wú)癥狀的病毒攜帶者，可將病毒粒子釋放到環(huán)境中去。

6 ABV的免疫防治

免疫防治是對(duì)IPNV進(jìn)行有效防治的重要措施。IPNV疫苗在控制IPNV的侵染過(guò)程中發(fā)揮了重要作用(McBeathetal.,2007)。利用桿狀病毒表達(dá)載體表達(dá)的IPNV Sp株的A片段可在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)自我組裝形成病毒樣顆粒(VLPs)；利用浸泡和免疫注射的方法測(cè)定了VLP的免疫原性，表明免疫效果與免疫方法和免疫劑量均有關(guān)系(Shivappaetal.,2005)。VP2蛋白的糖基化在引起IPNV感染的細(xì)胞的免疫反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用(Fridholmetal.,2007)。用在細(xì)菌、酵母、魚(yú)及哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的VP2蛋白免疫鮭魚(yú)，都能夠產(chǎn)生抗體(Labusetal.,2001)。在酵母中表達(dá)的VP2蛋白可以自我組裝成約20 nm的亞病毒顆粒，注射純的VP2亞病毒顆粒(rVP2-SVP)或喂食表達(dá)重組蛋白的酵母的虹鱒魚(yú)都可以檢測(cè)到IPNV抗體；口服或者注射rVP2-SVPs都可以引起魚(yú)的特異性免疫反應(yīng)，降低IPNV的侵染(Allnuttetal.,2007)。VP2還是開(kāi)發(fā)DNA疫苗的良好候選基因(de Las Herasetal.,2009)，用基于VP2基因的DNA疫苗口服免疫鮭魚(yú)，可有效激活鮭魚(yú)的免疫系統(tǒng)，攻毒結(jié)果顯示魚(yú)的存活率大大提高(de las Herasetal.,2010;Ballesterosetal.,2014)。VP3蛋白也是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白。用在大腸桿菌中表達(dá)的VP2和VP3免疫虹鱒魚(yú)，可誘導(dǎo)魚(yú)體產(chǎn)生抗體，但是免疫VP3魚(yú)體內(nèi)的抗體水平明顯高于免疫VP2魚(yú)體內(nèi)的抗體水平(Moonetal.,2004)。開(kāi)發(fā)基于IPNV結(jié)構(gòu)蛋白的多聯(lián)亞單位疫苗是防控IPNV的重要手段(Dharetal.,2010)。研究表明，在病毒裝配過(guò)程中的病毒前體可激活魚(yú)體的免疫系統(tǒng)(Rivas-Aravenaetal.,2012)，而獲得性免疫在免疫保護(hù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用(Munang'anduetal.,2014)。但有些疫苗雖然能刺激機(jī)體免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體，但并不能產(chǎn)生有效的保護(hù)作用，而在試驗(yàn)階段具保護(hù)作用的免疫制劑往往在生產(chǎn)中并不能真正起到保護(hù)作用，這就亟待開(kāi)發(fā)疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)體系。

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