基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜在臨床微生物檢測和鑒定中的應(yīng)用

宗玉龍，曹 源，褚芳波，張萍萍 綜述 胡成進(jìn) 審校

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜在臨床微生物檢測和鑒定中的應(yīng)用

宗玉龍1，曹 源2，褚芳波1，張萍萍1綜述 胡成進(jìn)2審校

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜；微生物；檢測；鑒定

現(xiàn)今臨床主要通過觀察細(xì)菌菌落形態(tài)、革蘭染色、顯微鏡檢查，以及各種生化試驗(yàn)等方法對致病菌進(jìn)行檢測和鑒定。這些方法主要依賴致病菌的生長代謝，其周期較長，并且?guī)в幸欢ǖ闹饔^性[1]，不能滿足臨床上對致病菌進(jìn)行快速診斷的需要?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption/ionization time-of-fight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)的誕生和發(fā)展奠定了用蛋白質(zhì)指紋圖譜鑒定微生物的基礎(chǔ)。通過檢測未知微生物的蛋白質(zhì)指紋圖譜并與質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫中特征性譜圖進(jìn)行比對，從而對待測微生物進(jìn)行快速鑒定。該技術(shù)具有速度快，靈敏度高，操作簡單，信息直觀，成本低廉等特點(diǎn)，在對病原微生物進(jìn)行快速鑒定方面具有良好的應(yīng)用前景。

MALDI-TOF MS 儀器主要由基質(zhì)輔助激光解吸離子源(MALDI)和飛行時(shí)間質(zhì)量分析器(TOF)兩部分組成。其基本原理是用一定強(qiáng)度的激光照射基質(zhì)與樣品形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量，將能量傳遞給樣品，使樣品解吸附，樣品和基質(zhì)之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移從而使樣品發(fā)生電離，電離的樣品在電場的作用下加速飛過飛行管道，并被檢測器檢測。不同離子的飛行時(shí)間與其質(zhì)量電荷比值成正比。完整的細(xì)菌可以產(chǎn)生特定的蛋白指紋圖譜，通過和數(shù)據(jù)庫中的圖譜進(jìn)行比對可以對未知微生物進(jìn)行鑒定。

1 檢測和鑒定細(xì)菌

近年來，用MALDI-TOF MS 鑒定細(xì)菌的報(bào)道不斷增加，顯示出這一技術(shù)在臨床病原菌鑒定中廣闊的應(yīng)用前景。MALDI-TOF MS 已被證明是鑒定細(xì)菌和酵母菌準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)的方法[2]。Bizzini等[3]對使用MALDI-TOF MS 的方法和傳統(tǒng)方法鑒定臨床分離細(xì)菌和酵母菌方法進(jìn)行了比較，用MALDI-TOF MS 的方法鑒定1371株已經(jīng)用傳統(tǒng)方法鑒定完成的臨床分離株，其中，1278株(93.2%)可以鑒定到種的水平，73株(5.3%)可以鑒定到屬的水平，不能夠準(zhǔn)確鑒定的有20株(1.5%)；在被鑒定到種的水平的1278株菌中，有63(4.9%)株的鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)方法的鑒定結(jié)果不一致，其中絕大多數(shù)(42/63)不一致的結(jié)果是由系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫相關(guān)分類的差異造成的，14株是由質(zhì)譜儀的分辨率較低造成的，另外的7株是由于傳統(tǒng)方法的鑒定錯(cuò)誤。這些結(jié)果表明，MALDI-TOF MS 具有取代使用傳統(tǒng)表型鑒定方法鑒定微生物的潛力。

Van Veen等[4]對980株臨床分離細(xì)菌和酵母菌進(jìn)行了前瞻性實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明，MALDI-TOF MS 對菌株進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定的準(zhǔn)確性要高于傳統(tǒng)的生化方法(92.2%和83.1%)。MALDI-TOF MS 可以準(zhǔn)確鑒定97.7%的腸桿菌科，92%發(fā)酵型革蘭陰性桿菌，94.3%的葡萄球菌，84.8%的鏈球菌及85.2%的酵母菌。對于混合細(xì)菌的指紋圖譜，Mahé等[5]使用了一種依賴物種特異性的非負(fù)線性回歸模型，這樣可以從常規(guī)參考數(shù)據(jù)庫中得到單一細(xì)菌的信息，從而檢測樣品中哪種細(xì)菌存在。其結(jié)果表明，這種方法可以自動(dòng)的檢測混合樣品中含有哪種細(xì)菌，使用這種方法可以鑒定約61.2%的樣本，其錯(cuò)誤鑒定率約為5.3%。

2 檢測和鑒定真菌

近年來，因酵母或酵母樣真菌所造成的重度感染逐漸增多，尤其多見于免疫功能不全的患者[6]。與用質(zhì)譜鑒定細(xì)菌相比，用質(zhì)譜的方法鑒定真菌的報(bào)道相對較少。這是因?yàn)檎婢?xì)胞壁硬度較大，對真菌或者其孢子進(jìn)行機(jī)械或者化學(xué)處理的方法雖然可以增加其表面蛋白的釋放，有利于真菌的鑒定，但與將細(xì)菌直接進(jìn)行質(zhì)譜測定相比，其耗時(shí)較長，且效率較低[6-8]。不過與傳統(tǒng)的生物學(xué)或生物化學(xué)的鑒定方法相比，MALDI-TOF MS 還是有許多優(yōu)勢。Bader和Weig[9]用MALDI-TOF MS 的方法鑒定了1192株酵母菌和類酵母真菌，并將鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)的鏡檢和生化測定方法的結(jié)果進(jìn)行了比較，二者均可以準(zhǔn)確鑒定95.1%的臨床分離株，但質(zhì)譜法錯(cuò)誤鑒定的發(fā)生率要比傳統(tǒng)方法低很多，此外，質(zhì)譜法還可以鑒別種屬關(guān)系較接近的菌種，這是MALDI-TOF MS 比傳統(tǒng)鑒定方法的一大優(yōu)勢。

MALDI-TOF MS 已經(jīng)成功鑒定了多種真菌，如曲霉屬真菌、鐮刀菌屬、青霉菌，以及臨床分離的不同酵母菌[10]。Marklein等[6]用MALDI-TOF MS 的方法鑒定了267株臨床分離的酵母菌和類酵母真菌，247(92.5%)株得到了準(zhǔn)確的菌種鑒定結(jié)果。Tan等[2]準(zhǔn)確鑒定了952株臨床分離株中的128株酵母菌分離株。Bille等[11]用MALDI-TOF MS 鑒定酵母菌和曲霉屬真菌的準(zhǔn)確率分別為98.8%(160/162)和98.4%(63/64)。

3 檢測細(xì)菌耐藥性

對抗生素耐藥的細(xì)菌近年來逐年增多，耐藥菌給重癥患者尤其是術(shù)后以及血液系統(tǒng)腫瘤的患者的感染治療帶來較大困難[12]。2000年，Edwards-Jones 等[13]用MALDI-TOF MS 的方法將金黃色葡萄球菌甲氧西林耐藥株和敏感株區(qū)分開來，隨后2002年，Du等[14]進(jìn)一步證明了此結(jié)論?，F(xiàn)今，對細(xì)菌耐藥性的檢測主要集中在以下幾個(gè)方向：檢測降解酶對抗生素的修飾、通過對多重耐藥菌的蛋白質(zhì)組學(xué)研究其耐藥機(jī)制的決定因素以及對某些靶位點(diǎn)如核糖體甲基化位點(diǎn)的分析[15]。Jung等[16]用MALDI-TOF MS 的方法快速檢測抗β-內(nèi)酰胺類抗生素的腸桿菌科細(xì)菌。通過檢測100例經(jīng)血培養(yǎng)得到的抗三代頭孢霉素的腸桿科細(xì)菌所表達(dá)的β-內(nèi)酰胺酶，并用傳統(tǒng)方法對檢測結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，用MALDI-TOF MS 的方法鑒定青霉素敏感株和耐藥株的敏感性和特異性均為100%。rRNA甲基化產(chǎn)生合成抗氨基糖苷類、氯霉素、克雷霉素的蛋白[17]，MALDI-TOF MS 的方法可以檢測rRNA的修飾[18]，將RNA用核酶降解后進(jìn)行質(zhì)譜檢測，將檢測結(jié)果與理論上的結(jié)果相比較，以檢測哪些核酸序列發(fā)生了修飾。多重耐藥菌的蛋白質(zhì)組學(xué)研究依賴于對耐藥株主要耐藥蛋白的蛋白指紋圖譜庫的建立，用這種方法鑒定耐藥株還需要進(jìn)一步的優(yōu)化與論證。用MALDI-TOF MS 技術(shù)鑒定細(xì)菌耐藥性還成功用于鑒定碳青霉烯類抗生素耐藥的細(xì)菌[19]，多重耐藥的肺炎克雷伯菌等[20]。

4 MALDI-TOF MS應(yīng)用評價(jià)及展望

4.1 主要優(yōu)點(diǎn) 用MALDI-TOF MS 的方法鑒定病原菌具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)操作簡單，某些細(xì)菌只需將單個(gè)菌落涂抹于靶板上，某些細(xì)菌的前處理需要先提取蛋白，檢測過程可通過提前設(shè)置好的自動(dòng)化鑒定程序完成，測定得到的質(zhì)譜圖經(jīng)軟件分析，打分后給出鑒定結(jié)果; (2)耗時(shí)較短，鑒定一個(gè)樣品需要5～10 min，這比傳統(tǒng)的方法具有很大的優(yōu)勢。Tan等[2]評估了臨床實(shí)驗(yàn)室鑒定細(xì)菌和真菌的時(shí)間，用MALDI-TOF MS 的方法平均要比傳統(tǒng)的鑒定方法提前1.45 d。(3)費(fèi)用低廉，MALDI-TOF 設(shè)備單次試驗(yàn)檢測費(fèi)用在$0.35 和 $0.79之間。Seng等[21]發(fā)現(xiàn)用MALDI-TOF MS 方法鑒定細(xì)菌的成本約占傳統(tǒng)鑒定方法成本的22%到32%。

4.2 應(yīng)用局限性 作為一種相對較新的細(xì)菌鑒定方法，MALDI-TOF MS 存在一些局限性。主要體現(xiàn)在：(1)數(shù)據(jù)庫還有待于進(jìn)一步的完善，現(xiàn)今MALDI Biotyper數(shù)據(jù)庫僅有不到4000種微生物的指紋，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床陽性檢出率和檢測準(zhǔn)確度的要求，數(shù)據(jù)庫還有待于進(jìn)一步擴(kuò)充;(2)對大多數(shù)病人標(biāo)本中的病原菌，MALDI-TOF MS 并不能進(jìn)行直接的鑒定，還需要對標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)。但對于病原菌含量較多的標(biāo)本可以直接進(jìn)行鑒定;(3)對耐藥菌株的檢測，MALDI-TOF MS 的方法也有一定的局限性。其對一些格蘭陰性耐藥菌的檢測效果較差，如肺炎鏈球菌和緩癥鏈球菌可以產(chǎn)生相似的16 S RNA蛋白，所以其蛋白譜圖也相似，這對鏈球菌的鑒別帶來了困難[1]。

4.3 展望 MALDI-TOF MS 方法簡便、快捷、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢是其在臨床微生物檢測領(lǐng)域具有極其廣闊的應(yīng)用前景，雖然其對一些樣本的鑒定還存在些許的局限性，相信隨著質(zhì)譜效果好，重復(fù)性高的通用試驗(yàn)試驗(yàn)方法的建立，以及質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫的建立和質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，MALDI-TOF MS 的方法必將成為臨床微生物鑒定的重要工具。

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(2014-04-21收稿 2014-05-28修回)

(責(zé)任編輯 岳建華)

全軍十二五重點(diǎn)基金資助項(xiàng)目 (BWS12J014)

宗玉龍，碩士研究生，E-mail:zongyulong88@126.com

1. 121001錦州，遼寧醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院；2. 250031濟(jì)南，濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科

胡成進(jìn)，E-mail:hcj6289@163.com

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