HCCR及其在消化系統(tǒng)腫瘤中的診療價(jià)值

舒婷婷，盧啟明，王巧麗，馮 婧

（1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

近十年，食管癌、胃癌和結(jié)腸癌等消化系統(tǒng)腫瘤在我國(guó)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。消化系統(tǒng)惡性腫瘤已成為危害人類健康最嚴(yán)重的腫瘤性疾病，其早期診斷對(duì)于及時(shí)確定治療方案和延長(zhǎng)患者生存期均有重要意義。目前認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是多種基因突變逐漸積累參與的復(fù)雜過(guò)程，由于環(huán)境及自身因素引起的多基因的突變，導(dǎo)致正常細(xì)胞的增殖、凋亡以及染色體的穩(wěn)定性改變，使腫瘤新生物具有了血管形成、侵襲及向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力[1-2]。因此，了解在腫瘤惡化早期起作用的基因的生物學(xué)功能，將會(huì)為腫瘤的預(yù)防、診斷提供線索，同時(shí)提高癌癥患者的生存率。目前臨床上常見(jiàn)的腫瘤標(biāo)記物篩查消化系統(tǒng)惡性腫瘤的效果很不理想，容易漏檢及出現(xiàn)假陽(yáng)性，急需發(fā)現(xiàn)靈敏度和特異性均較高的新腫瘤標(biāo)記物。人宮頸癌基因（HCCR）是由韓國(guó)科學(xué)家Ko等[3]發(fā)現(xiàn)的一種與多種腫瘤發(fā)生相關(guān)的原癌基因，對(duì)其功能研究表明，HCCR在早期腫瘤中的表達(dá)更明顯，提示HCCR與人類多種惡性腫瘤的早期發(fā)生有關(guān)，有可能成為惡性腫瘤基因治療的新靶點(diǎn)，為治療消化系統(tǒng)腫瘤帶來(lái)新的曙光。本文就HCCR在消化系統(tǒng)腫瘤中的研究進(jìn)展做一簡(jiǎn)要綜述。

1 HCCR 及其蛋白結(jié)構(gòu)

HCCR基因是Ko等[3]用差異顯示RT-PCR法，從原發(fā)子宮頸癌組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)灶及子宮頸癌細(xì)胞系CUMC-6中篩選、鑒定出一段異常表達(dá)有206bp的不完全cDNA片段，該片段稱為CC214，其定位于人染色體12q。由于前體mRNA選擇性拼接加工不同，可引起兩種選擇性剪切：HCCR-1和HCCR-2。HCCR-1由9個(gè)外顯子構(gòu)成，共編碼360個(gè)氨基酸，其編碼的蛋白分子量為42kDa，HCCR-2編碼序列除缺少HCCR-1外顯子（exon1）的部分序列外，其余編碼核苷酸序列與HCCR-1相同，HCCR-2可編碼304個(gè)氨基酸，其蛋白分子量為36kDa。這兩個(gè)亞型的3'非轉(zhuǎn)錄區(qū)是完全一致的。HCCR-2蛋白是HCCR-1蛋白的拼接變異體，在HCCR-1的258核苷酸區(qū)發(fā)生A與G的替換，造成HCCR-1的異亮氨酸轉(zhuǎn)換為HCCR-2的纈氨酸。NIH/3T3細(xì)胞軟瓊脂集落形成試驗(yàn)和裸鼠成瘤試驗(yàn)均提示HCCR-2的致癌性比HCCR-1更強(qiáng)。

2 人類腫瘤發(fā)生的細(xì)胞生化機(jī)制

Ko等[4]在2004年構(gòu)建了含有HCCR-2的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，其形成的腫瘤表現(xiàn)出上皮癌的特征，在體內(nèi)模擬了HCCR-2強(qiáng)制表達(dá)可單獨(dú)誘發(fā)乳腺癌及轉(zhuǎn)移灶。但是HCCR同人類腫瘤發(fā)生的細(xì)胞和生化機(jī)制還不是十分清楚。Cho等[5]對(duì)熒光素酶進(jìn)行活性分析表明，HCCR-1的5'側(cè)翼區(qū)-166到30的基因片段在HCCR-1轉(zhuǎn)錄活性中起著重要作用。經(jīng)過(guò)對(duì)這個(gè)區(qū)域的計(jì)算分析確定了兩個(gè)位于-26到-4（Tcf1）和-136到-114（Tcf2）的T-細(xì)胞因子受體。遷移率變動(dòng)分析（EMSA）顯示，核蛋白質(zhì)只特異結(jié)合Tcf1區(qū)域，而非Tcf2區(qū)域，突變?cè)赥cf1區(qū)域?qū)е罗D(zhuǎn)錄活性顯著降低。使用熒光素酶和Wnt信號(hào)激活阻斷劑GSK-3β（糖原合成酶激酶-3）后，含有Tcf1的野生型構(gòu)建體報(bào)告活動(dòng)顯著增強(qiáng)，但含有Tcf1突變的構(gòu)建體細(xì)胞則不被影響。此外，內(nèi)源性HCCR-1的表達(dá)也增強(qiáng)。同時(shí)還觀察到，轉(zhuǎn)錄因子、Tcf、共刺激因子β-連環(huán)蛋白都結(jié)合Tcf1區(qū)域位點(diǎn)。HCCR-1的Tcf1區(qū)域是一個(gè)調(diào)節(jié)HCCR-1的表達(dá)和本區(qū)域異常刺激的主要區(qū)域，可誘發(fā)各種癌癥。2007年Cho等[6]又利用生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)了HCCR-1蛋白的生物特性，并確定了HCCR-1蛋白從75位到346位的氨基酸序列為L(zhǎng)ETM1同源結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含不同種的線粒體蛋白。熒光顯微鏡和分餾實(shí)驗(yàn)表明，HCCR-1定位在綠猴腎細(xì)胞系COS-7、人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和人胚腎HEK/293細(xì)胞系的線粒體內(nèi)膜。拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，HCCR-1的NH2末端朝向細(xì)胞質(zhì)，該D1-2區(qū)即HCCR-1蛋白第1～110位氨基酸序列，是轉(zhuǎn)錄后的線粒體入口，具有線粒體生物學(xué)功能。

3 HCCR-2 與P53

P53具有“分子警察”的功能，P53蛋白的缺失、突變和失活，在惡性腫瘤的激化演變過(guò)程中起著重要的作用[7]。P53蛋白的主要功能包括誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、修復(fù)DNA損傷和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而避免受損DNA的堆積、維持基因組的持續(xù)穩(wěn)定以及調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化與衰老、抑制腫瘤血管增生等。P53的下游基因主要包括P21、CD95/fas、P53AIP1、pag608、gadd45、MDM2、Bax、Cyclin等[8]。Ko等將轉(zhuǎn)染HCCR的NIH/3T3細(xì)胞注入裸鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)有腫瘤形成，而P53蛋白總表達(dá)卻未見(jiàn)下降，進(jìn)一步檢測(cè)P53蛋白下游的P21、MDM2、Bax基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其水平均有所降低，表明P53蛋白總量雖然保持穩(wěn)定，卻不能保持正常功能[4]。楊燕等[9]構(gòu)建表達(dá)HCCR小干擾RNA的真核表達(dá)質(zhì)粒pRIV2-siHCCR，將其轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞。Westernblot（蛋白質(zhì)印跡法）結(jié)果顯示，HCCR小干擾RNA作用HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)P53蛋白的表達(dá)降低，P15蛋白的表達(dá)明顯升高，而PTEN、P16、P27蛋白水平?jīng)]有明顯改變。這也進(jìn)一步表明HCCR與P53蛋白的關(guān)系不簡(jiǎn)單，一般認(rèn)為它可能與P53的負(fù)性調(diào)節(jié)有關(guān)，通過(guò)使P53表達(dá)下降或者失活，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

4 HCCR 的調(diào)節(jié)機(jī)制

Cho等[10]觀察HCCR-1的5'側(cè)翼區(qū)，并確定包括假定性同源結(jié)構(gòu)域蛋白結(jié)合位點(diǎn)的HCCR-1啟動(dòng)子。NIH/3T3（小鼠胚胎成纖維細(xì)胞）中HCCR-1啟動(dòng)子被磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）激活，此啟動(dòng)子在K562細(xì)胞中也能夠被野生型Akt活化。使用PI3K特異性抑制劑LY294002作用后，HCCR-1的表達(dá)下降，并呈劑量依賴性。這些結(jié)果表明，HCCR-1的表達(dá)受PI3K/Akt調(diào)節(jié)。張盛等[11]在胰腺癌細(xì)胞SW1990中驗(yàn)證了這一通路。使用表皮生長(zhǎng)因子（EGF）處理胰腺癌細(xì)胞SW1990，隨著作用時(shí)間增加，HCCR表達(dá)水平增高。使用PI3K/Akt通路抑制劑后，HCCR表達(dá)水平明顯下降。

Shin等[12-13]研究發(fā)現(xiàn)，HCCR-1通過(guò)與HCCR-1結(jié)合蛋白-1（HCCRBP-1）作用，直接穩(wěn)定P53的作用，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。最近Ha等[14]又發(fā)現(xiàn)一種新的HCCR-1結(jié)合蛋白HCCRBP-3。HCCRBP-3在多種腫瘤中過(guò)度表達(dá)，NIH/3T3細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的裸鼠注射HCCRBP-3也能誘發(fā)腫瘤的形成。此外，P53在HCCRBP-3轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中表現(xiàn)功能障礙并伴隨P21和Bax誘導(dǎo)缺陷。P53的反應(yīng)性元件P21基因啟動(dòng)子活性被HCCRBP-3以劑量依賴性方式抑制。因此，研究表明HCCRBP-1、HCCRBP-3有助于HCCR-1通過(guò)中斷P53功能誘導(dǎo)腫瘤形成。

Shin等發(fā)現(xiàn)從K562細(xì)胞核中提取的蛋白質(zhì)有識(shí)別和綁定位于HCCR-1啟動(dòng)子的Tcf1區(qū)域的野生型特定序列的作用。他們構(gòu)建了數(shù)個(gè)HCCR-1的近端啟動(dòng)子區(qū)域的刪除突變體，用GSK-3β 阻斷劑處理HEK/293和K562細(xì)胞后，內(nèi)源性HCCR-1的合成增加。這些發(fā)現(xiàn)表明，HCCR-1啟動(dòng)子的Tcf1區(qū)域是一個(gè)主要調(diào)節(jié)HCCR-1表達(dá)的區(qū)域。異常刺激本區(qū)域可能誘發(fā)各種癌癥。

HCCR通過(guò)線粒體激活介導(dǎo)途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡異常參與腫瘤的發(fā)生。體外研究顯示，HCCR-1蛋白是線粒體膜上K/H離子交換泵的重要組分，K/H交換泵的缺陷會(huì)引起線粒體腫脹和凋亡，HCCR的過(guò)度表達(dá)可以引起線粒體生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[6-15]。

5 臨床應(yīng)用前景

目前，惡性消化系統(tǒng)腫瘤臨床進(jìn)展快、患者生存期短，傳統(tǒng)臨床治療的中遠(yuǎn)期療效不理想，因而尋找新的腫瘤治療方法是全球臨床及科研工作者所面臨的問(wèn)題。通過(guò)cDNA陣列比較雜交法（comparativehybridizationofcDNAarrays）、RT-PCR和Northerm印跡雜交等方法分析肝癌及癌旁組織中的基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示，HCCR在肝癌組織中高表達(dá)，但在癌旁組織中不表達(dá)[16-17]。HCCR這種在腫瘤組織中高選擇性表達(dá)的特點(diǎn)，使得靶向HCCR的基因治療能夠精確定位于癌變組織，有效破壞癌變細(xì)胞特有的生存機(jī)制，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低腫瘤的生長(zhǎng)潛能。因此，以HCCR為靶點(diǎn)的各種治療技術(shù)有望成為臨床腫瘤治療新的切入點(diǎn)。目前的研究主要集中在RNA干擾（RNAi）技術(shù)、反義寡核苷酸技術(shù)、抗體制備技術(shù)這幾方面。

RNA干擾是通過(guò)短雙鏈RNA與mRNA中的同源序列結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物，誘導(dǎo)靶基因降解，進(jìn)而高效特異性阻斷目的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默的技術(shù)。姜琳等[18]研究食管癌EC9706細(xì)胞HCCR-2的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，下調(diào)HCCR-2蛋白及mRNA的表達(dá)，觀察到細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞周期出現(xiàn)G0/G1期阻滯，P53下游基因P21與P27的表達(dá)增加。

反義寡核苷酸技術(shù)是根據(jù)堿基互補(bǔ)原理，用人工合成或設(shè)計(jì)目標(biāo)DNA或mRNA的序列片段，從而抑制或封閉目標(biāo)靶基因表達(dá)和功能發(fā)揮的基因封閉技術(shù)。劉安定等[19]構(gòu)建了pcDNA3.1-HCCR反義真核表達(dá)質(zhì)粒，利用反義RNA技術(shù)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)顯示HCCRmRNA表達(dá)降低。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)HCCRmRNA水平下降到16%，其蛋白表達(dá)水平在24小時(shí)也明顯降低。對(duì)細(xì)胞的增殖與凋亡活性檢測(cè)顯示：轉(zhuǎn)染HCCR反義質(zhì)粒后，HepG2細(xì)胞增殖受到抑制，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)抑制率為47.62%，細(xì)胞凋亡率為14.34%±0.91%，細(xì)胞分裂多停止在G0、G1期。這些結(jié)果表明，可以以HCCR為靶點(diǎn)進(jìn)行基因?qū)耄瑥亩M(jìn)一步增強(qiáng)癌癥的治療效果，遏制惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

國(guó)內(nèi)張曉勇等[20-22]致力于制備HCCR重組蛋白和單克隆抗體的研究。耿東進(jìn)等[21]在細(xì)菌中制備了HCCR-1和HCCR-2蛋白質(zhì)，其分泌抗體效價(jià)高且均能特異識(shí)別重組蛋白，為建立新的早期診斷方法和開(kāi)發(fā)腫瘤疫苗奠定了可靠基礎(chǔ)。

6 展望

隨著對(duì)HCCR機(jī)制和功能的理解不斷加深，我們逐漸意識(shí)到其對(duì)于人類惡性腫瘤預(yù)防與治療的重要性。早期測(cè)定HCCR的水平，不但可以篩選出具有惡性轉(zhuǎn)化可能的高危病變，便于及早進(jìn)行預(yù)防和采取治療措施，而且將HCCR應(yīng)用于制備腫瘤疫苗，也會(huì)給腫瘤的治療帶來(lái)新的契機(jī)[23-24]。對(duì)于這種基因，其自身激活、致癌機(jī)制以及與其他分子的相互作用等還有許多問(wèn)題尚未研究清楚，我們還需要更多前瞻性的臨床研究來(lái)測(cè)試和驗(yàn)證。

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