鄭純麗 衷明華
(韓山師范學(xué)院化學(xué)系,廣東 潮州 521041)
余甘子葉Phyllanthus emblica L.系大戟科( Euphorbiaceae)葉下珠屬( Phyllanthus)落葉小喬木或灌木的葉。其具有廣泛的藥理作用,能清除自由基、抗氧化、抗肝損傷、抗炎、抗誘變、抗致畸和抗腫瘤等[1]。
黃酮是廣泛存在于自然界的一大類化合物,存在于植物的所有部分,包括根、心材、樹皮、葉、果實(shí)和花中[2]。植物中總黃酮的提取方法主要有乙醇浸提法、微波萃取法、超聲波法、酶解法等。目前關(guān)于余甘子葉中黃酮類化合物提取的研究報道并不多見,所以本課題以乙醇為溶劑超聲波輔助提取余甘子葉中的總黃酮,并對其最佳提取條件進(jìn)行研究。
余甘子葉采摘于汕頭市潮陽區(qū)。
DDG-9240電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密儀器儀表有限公司);
JFSD-100-Ⅱ粉碎機(jī)(上海嘉定糧油儀器有限公司);
T-214型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);
15QC73-30升旋片式真空泵(廣東省清城醫(yī)療器械廠);
KQ-250型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司);
TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。
蘆丁、石油醚、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉。
2.1.1 材料預(yù)處理
將采摘回來的余甘子葉進(jìn)行篩選,用蒸餾水清洗,晾干后于60℃的干燥箱中干燥48h,充分干燥后粉碎、進(jìn)行二次篩選,將篩選所得粉末裝入干凈的藥劑瓶中,備用。
2.1.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
精密稱取在100℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg ,用50%的乙醇溶液溶解,并轉(zhuǎn)入100 mL 的容量瓶中,用50%的乙醇溶液稀釋到刻度,搖勻,使之成為濃度為0.2mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。
2.1.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
分別取0.5mL,1.0mL、1.5mL、2.0mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL,4.5mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于8支25 mL比色皿中。加入1 mL5%亞硝酸鈉溶液,搖勻,放置7 min,加入1 mL10%硝酸鋁溶液,搖勻,放置7 min,加10 mL10%氫氧化鈉,加50%的乙醇溶液至刻度,搖勻,放置15 min 。按分光光度法,在510 nm 波長處測定吸光度,用空白試劑做參比。
以吸光度A為縱坐標(biāo)y,濃度C為橫坐標(biāo)x,得到蘆丁質(zhì)量濃度C和吸光值A(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程
y=9.8350x+0.0388,R2=0.9945。即A=9.8350C+0.0388
2.1.4 總黃酮的含量測定
用電子天平精確稱取粉碎后的余甘子葉粉末1.0000g,用石油醚出去余甘子葉中的脂類和部分色素。加入一定濃度乙醇,在一定的時間和溫度下采用超聲波法提取。提取后將溶液定容為100mL,即為待測液。
取1mL上層提取液于25mL比色管中,加入1mL5%亞硝酸鈉溶液,搖勻,放置7min后加入1mL10%硝酸鋁溶液,搖勻,放置6min后,再加入10mL氫氧化納溶液,用乙醇稀釋至刻度,搖勻,放置15min后在510nm處,測定其吸光度,用空白試劑做參比。
由蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程可以計(jì)算出黃酮的含量,進(jìn)而得出黃酮的提取率。
總黃酮含量(mg)=C×n×100
總黃酮提取率/% =(總黃酮含量/余甘子葉粉末的質(zhì)量)×100%
式中:C 為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的總黃酮質(zhì)量濃度/(mg/mL);n 為稀釋倍數(shù)。
2.2.1 乙醇濃度對黃酮提取率的影響
用電子天平精確稱取6份1.0000g的余甘子葉粉末,加入25倍量體積的石油醚靜置25min,除去余甘子葉中的脂類和部分色素,抽濾后將濾渣烘干。分別加入30ml濃度為30%,40%,50%,60%,70%,80%的乙醇溶液,在溫度為50℃,功率為250W的超聲波清洗器中提取40min,趁熱過濾,在510nm處測定吸光度,并計(jì)算黃酮的含量和提取率,結(jié)果見表1和圖1 。
表1 乙醇濃度對黃酮提取率的影響表
圖1 乙醇濃度對黃酮提取率的影響圖
由圖1可以看出,隨著乙醇濃度的增加,黃酮的提取率增加。當(dāng)乙醇濃度在40%-70% 時,隨著乙醇濃度的增加,黃酮的提取率增幅不大,當(dāng)乙醇濃度>70% 時,黃酮的提取率隨著乙醇濃度的增加大幅度增加。當(dāng)乙醇的濃度達(dá)到80%時,黃酮的含量最多。為了提高提取率,節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本,所以不考慮乙醇濃度大于80%對黃酮提取率的影響,因此確定乙醇的最佳濃度為80% 。
2.2.2 提取時間對黃酮提取率的影響
用電子天平精確稱取6份1.0000g的余甘子葉粉末,加入25倍量體積的石油醚靜置25min,除去余甘子葉中的脂類和部分色素,抽濾后將濾渣烘干。加入濃度為80%的乙醇溶液,在溫度為50℃,功率為250W的超聲波清洗器中分別提取10min,20min,30min,40min,50min,60min,趁熱過濾,在510nm處測定吸光度,并計(jì)算黃酮的含量和提取率,結(jié)果見表2和圖2 。
表2 提取時間對黃酮提取率的影響表
圖2 提取時間對黃酮提取率的影響圖
由圖2可以看出,隨著提取時間的增加,黃酮的提取率先大幅度增加后趨于平緩,當(dāng)提取時間為60min時,黃酮的含量最多。由于過長時間的高溫提取對化合物結(jié)構(gòu)有影響,所以將不對于大于60min的提取時間進(jìn)行實(shí)驗(yàn),故選擇最佳的提取時間為60min 。
2.2.3 料液比對黃酮提取率的影響
用電子天平精確稱取6份1.0000g的余甘子葉粉末,加入25倍量體積的石油醚靜置25min,除去余甘子葉中的脂類和部分色素,抽濾后將濾渣烘干。分別加入濃度為80%的乙醇溶液10ml,15ml,20ml,25ml,30ml,35ml,在溫度為50℃,功率為250W的超聲波清洗器中提取60min 。趁熱過濾,在510nm處測定吸光度,并計(jì)算黃酮的含量和提取率,結(jié)果見表3和圖3。
表3 料液比對黃酮提取率的影響表
圖3 料液比對黃酮提取率的影響圖
由圖3可以看出,隨著溶劑量的增加,黃酮的提取率逐漸減少,當(dāng)料液比為1:10時,黃酮的含量最多,因?yàn)橐紤]余甘子葉中的有效物質(zhì)是否充分溶出,所以不探討溶劑量小于10ml的實(shí)驗(yàn),因此該實(shí)驗(yàn)選擇最佳的料液比是1:10 。
為了進(jìn)一步優(yōu)化超聲波提取總黃酮的條件,在以上單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對影響余甘子葉總黃酮得率的因素:乙醇濃度(A)、提取時間(B)、料液比(C)進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn),并以總黃酮含量作為提取工藝的判斷指標(biāo)。結(jié)果見表4、表5 。
表4 正交試驗(yàn)因素水平表
表5 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果
由表5的極差分析可知,因素間的交互作用對余甘子葉黃酮的提取影響很大,在本實(shí)驗(yàn)中,均值最大的其提取率最高。從表中可以看出,3種因素料液比對黃酮的提取率影響最大,由極差值可得出,各因素對余甘子葉中總黃酮提取率影響大小依次為C>A>B,即料液比>乙醇濃度>提取時間。提取余甘子葉總黃酮的最佳工藝參數(shù)為A3B2C1,即乙醇濃度為80%,提取時間為40min,料液比為1:10 。
本實(shí)驗(yàn)以乙醇為溶劑超聲波輔助提取余甘子葉中的總黃酮。分析乙醇濃度、料液比和提取時間三個單因素對黃酮提取率的影響,采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測定,在波長為510nm測定余甘子葉中黃酮的吸光度,進(jìn)而得出黃酮的含量,找出其最佳水平,進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明料液比對余甘子葉黃酮的提取率影響最大,乙醇濃度次之,提取時間影響最小。提取余甘子葉總黃酮的最佳工藝參數(shù)為A3B2C1,即當(dāng)乙醇濃度為80%,提取時間為40min,料液比為1:10,黃酮的提取率為19.32% 。
用超聲波法具有較高的提取率[3],工藝條件簡單,操作控制容易,穩(wěn)定性好,克服了常規(guī)方法提取時間長需要加熱處理操作步驟繁瑣等缺點(diǎn)[4],具有廣闊的前景。
[1]鐘振國,黃金蘭,梁紅,等.余甘子葉化學(xué)成分沒食子酸對人肝癌BEL-7404細(xì)株凋亡的影響[J].中藥材,2009,32(7):1097~1100.
[2]王芙蓉,吳冬青,安紅鋼,等.當(dāng)歸總黃酮提取工藝及體外抗氧化性研究[J].中醫(yī)獸醫(yī).
[3]蔡健,華景清,王薇,等.黃酮提取工藝研究進(jìn)展[N].淮陰工學(xué)院學(xué)報,2003,12(5):82~85.
[4]王漢卿,王文蘋,閆津金,等.超聲提取枸杞葉中總黃酮提取工藝及其不同采收期含量變化研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(8):44~47.