抗TNF-α 和IL-1β IgY 抗體治療豚鼠過敏性鼻炎機理研究①

朱喜玲 胡微煦 吳梨華 文 珠 何 丹 吳曉牧 胡國柱

(江西省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所，南昌 330006)

過敏性鼻炎(Allergic rhinitis，AR)是由IgE 介導、Th2 細胞免疫反應增強以及Th2 細胞因子IL-4、IL-5、IL-9、IL-13 增加所致的嗜酸性粒細胞浸潤為主的鼻黏膜Ⅰ型變態(tài)反應性炎癥疾?。?，2］，且多數(shù)患者伴發(fā)支氣管哮喘［3，4］。雖然Th2 細胞因子在上下呼吸道過敏性炎癥病理反應中起重要作用，但前炎癥因子(Proinflammatory cytokine)IL-1β、TNF-α、IL-33 等不僅參與AR 的過敏性炎癥病理反應［5-11］，同時也刺激免疫活性細胞、氣道上皮、平滑肌等產(chǎn)生Th2 細胞因子及IL-6、IL-8、GM-CSF 等炎癥因子，以及IgE 和黏蛋白(MUC5AC)，并促進嗜酸性粒細胞浸潤。我們以往證明阻斷IL-1β 抑制了卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)誘導的豚鼠過敏性支氣管哮喘的病理反應、降低了血液和支氣管灌洗液中嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、淋巴細胞以及Th2 細胞因子IL-4、IL-13，前炎癥因子IL-1β、TNF-α 及IL-8、TGFβ1 和IgE 等［12］。Nomura 等［13］證明IL-1β 或TNF-α能刺激鼻黏膜纖維母細胞產(chǎn)生IL-33。因此，本文通過抗TNF-α 和IL-1β IgY 局部治療OVA 誘導的過敏性鼻炎模型豚鼠，探討其作用及機制，以期為過敏性鼻炎的臨床治療尋找新的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 Hartley 豚鼠，雄性，7 周齡，體重(200±50)g(購自上海嚙齒類動物研究中心，許可證號:SXCK(滬)2012-0008)?？筎NF-α 和IL-1β IgY (本室制備，純度85%，效價1∶3 200/mg 蛋白);丙酸氟替卡松(濃度0.05%，英國Glaxsmithk 公司);卵清白蛋白(Sigma 公司);氫氧化鋁凝膠(美國Thermo scientific 公司);抗TNF-α 抗體(中國Anbo 公司);抗IL-5 和IL-1β 抗體(美國Immuno Way 公司);抗IL-33 抗體(美國Santa-Cruz 公司)。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠過敏性鼻炎模型建立133 只豚鼠隨機分正常對照組(C 組，17 只)和過敏性鼻炎模型建立組(116 只)。建立豚鼠過敏性鼻炎模型方法見［14］。簡言之，正常對照組(C 組)基礎免疫和加強免疫(激發(fā))均采用每側鼻孔滴注0.1ml 生理鹽水。建立過敏性鼻炎模型(n=116)基礎致敏時腹腔注射1 ml 的0.03%OVA+3.0%氫氧化鋁，隔日1 次，共7 次;然后采用OVA 皮內(nèi)注射法 鑒定豚鼠致敏是否成功(紅斑和皮丘直徑大于1.0 mm 為致敏成功)［15］;致敏成功的豚鼠休息7 d 后(剩余69 只)采用2.0%OVA 滴鼻激發(fā)3 次(0.1 ml/每側鼻孔，每天1 次)，然后根據(jù)豚鼠過敏癥狀評分結果將建模的豚鼠在第4 次攻擊時分成模型組(M 組，n=27)，0.1 ml 生理鹽水滴鼻后再滴鼻2.0% OVA 激發(fā);0.1%抗TNF-α 和IL-1β IgY 治療組(Z1 組，n=21)，0.1 ml 0.1%抗TNF-α 和IL-1β IgY 滴鼻后再滴鼻2.0%OVA 激發(fā);丙酸氟替卡松治療組(Z2 組，n=21)，0.1 ml 丙酸氟替卡松滴鼻后再滴鼻2.0%OVA 激發(fā);每天1 次，共7 次。

1.2.2 豚鼠過敏性鼻炎癥狀觀察 加強免疫后30 min 內(nèi)對豚鼠抓鼻、打噴嚏、流涕等表現(xiàn)進行觀察并評分。評分標準見參考文獻［16］，達到5 分為建模成功。

1.2.3 細胞染色 將NLF 和BALF 沉淀細胞涂片，瑞氏吉姆薩染色液染色3 min，再滴加PBS 繼續(xù)染色10 min，沖洗晾干，在高倍(400 ×)顯微鏡下計數(shù)300 個炎癥細胞并分類計算百分率。

1.2.4 鼻黏膜及肺組織蘇木精-伊紅染色 處死豚鼠分離鼻黏膜及肺，10%甲醛固定，脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察組織病理變化。選取5 個區(qū)域計數(shù)嗜酸性粒細胞數(shù)量，結果以±s表示。

1.2.5 免疫組化染色 采用二步法免疫組化染色檢測鼻黏膜和肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-5 和IL-33在細胞中的表達，并測定光密度值。

1.3 統(tǒng)計學分析 實驗結果采用SPSS19.0 軟件包進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用±s 表示，各組樣本均數(shù)間比較采用One-way ANOVA 分析，若方差齊性，采用LSD 法比較兩組之間差異;若方差不齊性，采用多重秩和檢驗，多重比較采用Mann-Whiteney 法，以P ＜0.05 表示差異有顯著性。

2 結果

2.1 癥狀變化 豚鼠致敏階段就出現(xiàn)抓鼻、打噴嚏、流涕、呼吸加快，甚至呼吸困難、紫紺、抽搐、甚至窒息。OVA 加強免疫(激發(fā))階段首個10 min 豚鼠出現(xiàn)明顯抓鼻、打噴嚏、呼吸加快;第2 個10 min 抓鼻和打噴嚏減少，但出現(xiàn)流鼻涕;第3 個10 min 抓鼻、打噴嚏不明顯，仍流涕。從第4 次激發(fā)開始治療，其Z1 組和Z2 組豚鼠抓鼻和打噴嚏次數(shù)以及流涕量逐漸減少(P ＜0.05)，見表1。在激發(fā)階段，經(jīng)治療的豚鼠死亡率Z1 組為11.11%、Z2 組為29.41%，而M 組高達40.0%。

表1 各組豚鼠過敏性鼻炎癥狀評分(±s)Tab.1 Comparison of symptom scores in guinea pig with allergic rhinitis during different groups(±s)

表1 各組豚鼠過敏性鼻炎癥狀評分(±s)Tab.1 Comparison of symptom scores in guinea pig with allergic rhinitis during different groups(±s)

Note:Compared with group C，1)P ＜0.05;Compared with group M，2)P ＜0.05.

表2 各組豚鼠NLF 中炎癥細胞分類比較(±s，%)Tab.2 Comparison of inflammatory cells in nasal lavage fluid in guinea pig with allergic rhinitis during different groups(±s，%)

表2 各組豚鼠NLF 中炎癥細胞分類比較(±s，%)Tab.2 Comparison of inflammatory cells in nasal lavage fluid in guinea pig with allergic rhinitis during different groups(±s，%)

Note:Compared with group C，1)P ＜0.05;Compared with group M，2)P ＜0.05.

2.2 鼻灌洗液及支氣管肺灌洗液炎癥細胞含量變化

2.2.1 鼻灌洗液炎癥細胞含量變化 鼻灌洗液中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞在四組之間2～8 h 差異具有顯著性(P ＜0.01)，模型組(M 組)的嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞均顯著高于正常對照組(C 組)(P ＜0.05)，而巨噬細胞顯著低于C 組(P ＜0.05)。在Z1 組和Z2 組，嗜酸性粒細胞和巨噬細胞在2～8 h 顯著低于M 組(P ＜0.05)。在Z1 組4 h，Z2 組2～8 h 中性粒細胞也顯著低于M 組(P ＜0.05)。淋巴細胞在Z1 組2 和4 h，Z2 組2 h 和8 h 顯著低于M 組(P ＜0.05)，見表2。

2.2.2 支氣管肺灌洗液炎癥細胞含量變化 支氣管肺灌洗液中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞在四組之間2、4、8 h 差異顯著(P ＜0.01)，其中M 組嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞在2～8 h 顯著高于正常對照組(C 組)(P ＜0.05)，而巨噬細胞M 組顯著低于C 組(P ＜0.05)。嗜酸性粒細胞和巨噬細胞在Z1 組和Z2 組的2～8 h 顯著低于M 組(P ＜0.05)。在Z1 組2 和8 h 中性粒細胞顯著低于M 組，在Z1 組2 h 和Z2 組2～8 h 淋巴細胞也顯著低于M 組(P ＜0.05)，見表3。

2.3 鼻黏膜及肺組織病理變化

2.3.1 鼻黏膜 在2～8 h，正常對照組(C 組)偶見淋巴細胞浸潤(見圖1A);模型組(M 組)有大量嗜酸性粒細胞及淋巴細胞浸潤于上皮和固有層，黏膜水腫，部分上皮細胞脫落，血管內(nèi)有炎癥細胞浸潤(見圖1B)。在2 和4 h，0.1%抗TNF-α 和IL-1β IgY 治療組(Z1 組)和丙酸氟替卡松治療組(Z2 組)有少量嗜酸性粒細胞和淋巴細胞浸潤于黏膜固有層、甚至上皮層，黏膜水腫較輕，上皮較完整;在8 h，嗜酸性粒細胞和淋巴細胞進一步減少，黏膜水腫消退(見圖1 C 和D)。

2.3.2 肺組織 在2～8 h，正常對照組(C 組)偶見淋巴細胞浸潤(見圖2A);模型組(M 組)支氣管上皮細胞部分脫落、肺間質(zhì)水腫，肺泡隔增厚、斷裂，管壁平滑肌增厚，肺泡隔和支氣管、血管周圍嗜酸性粒細胞和淋巴細胞浸潤嚴重(見圖2B);0.1%抗TNFα 和IL-1β IgY 治療組(Z1 組)肺泡隔輕度增寬，肺泡隔和支氣管旁少量嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，管腔干凈(見圖2C 和D)。

2.3.3 鼻黏膜和肺組織嗜酸性粒細胞變化 豚鼠鼻黏膜和肺組織中在2、4、8 h，M 組浸潤的嗜酸性粒細胞數(shù)量較正常對照組(C 組)、Z1 和Z2 組顯著增加(P ＜0.05)，見表4。

表3 各組豚鼠BALF 中炎癥細胞分類比較(±s，%)Tab.3 Comparison of inflammatory cells in bronchoalveolar lavage fluid in guinea pig with allergic rhinitis during different groups(±s，%)

表3 各組豚鼠BALF 中炎癥細胞分類比較(±s，%)Tab.3 Comparison of inflammatory cells in bronchoalveolar lavage fluid in guinea pig with allergic rhinitis during different groups(±s，%)

Note:Compared with group C，1)P ＜0.05;compared with group M，2)P ＜0.05;compared with group Z1，3)P ＜0.05.

圖1 鼻黏膜形態(tài)(HE 染色，光鏡10 ×20)Fig.1 Morphological slice of nasal mucosa(HE staining，10 ×20 times in hight microscope)

圖2 肺組織形態(tài)(HE 染色，光鏡10 ×20)Fig.2 Morphological slice of lung tissues(HE staining，10 ×20 times in hight microscope)

表4 各組豚鼠鼻組織和肺組織嗜酸性粒細胞計數(shù)(±s，%)Tab.4 Comparison of eosinophilic cell count in nasal mucosa and lung tissues in guinea pig with allergic rhinitis during different groups (±s，%)

表4 各組豚鼠鼻組織和肺組織嗜酸性粒細胞計數(shù)(±s，%)Tab.4 Comparison of eosinophilic cell count in nasal mucosa and lung tissues in guinea pig with allergic rhinitis during different groups (±s，%)

Note:N.Numbers of guinea pig;compared with group C，1)P ＜0.05;compared with group M，2)P ＜0.05.

2.4 鼻黏膜及肺組織IL-1β、TNF-α、IL-5 和IL-33的表達

2.4.1 鼻黏膜IL-1β 等的表達 IL-1β、TNF-α、IL-5 和IL-33 的表達主要位于黏膜上皮細胞和固有層腺體細胞的胞內(nèi)。前炎癥因子IL-1β 在Z1 組2 h時表達就顯著下降，8 h 時表達仍顯著低于M 組(P ＜0.05);TNF-α，IL-33 和IL-5 在4～8 h 顯著低于M 組(P ＜0.05，見表5)。

2.4.2 肺組織IL-1β 等的表達 IL-1β、TNF-α、IL-5 和IL-33 的表達主要位于肺泡上皮、肺泡隔腺體細胞和支氣管黏膜上皮細胞的胞內(nèi)。前炎癥因子IL-1β 在Z1 組從2～8 h 和TNF-α 從2～4 h 表達顯著低于M 組(P ＜0.05)。IL-33 和IL-5 在4～8 h 顯著低于M 組(P ＜0.05，見表6)。

表5 各組豚鼠鼻黏膜炎癥細胞因子平均光密度值比較(±s，n=3)Tab.5 Comparison of mean optical density of inflammatory cytokines in nasal mucosa in guinea pig with allergic rhinitis during different groups (±s，n=3)

表5 各組豚鼠鼻黏膜炎癥細胞因子平均光密度值比較(±s，n=3)Tab.5 Comparison of mean optical density of inflammatory cytokines in nasal mucosa in guinea pig with allergic rhinitis during different groups (±s，n=3)

Note:1)Compared with group C，P ＜0.05;2)Compared with group M，P ＜0.05.3)Compared with group Z1，P ＜0.05.

表6 各組豚鼠肺組織炎癥細胞因子平均光密度值比較(±s，n=3)Tab.6 Comparison of mean optical density of inflammatory cytokines in lung tissue in guinea pig with allergic rhinitis during different groups(±s，n=3)

表6 各組豚鼠肺組織炎癥細胞因子平均光密度值比較(±s，n=3)Tab.6 Comparison of mean optical density of inflammatory cytokines in lung tissue in guinea pig with allergic rhinitis during different groups(±s，n=3)

Note:Compared with group C，1)P ＜0.05;compared with group M，2)P ＜0.05，Compared with group Z1，3)P ＜0.05.

3 討論

過敏性鼻炎抗原激發(fā)后5～30 min 鼻黏膜出現(xiàn)過敏早期反應，其為IgE 依賴性［17-19］，如:抓鼻、打噴嚏、流涕、呼吸加快，甚至呼吸困難、紫紺、抽搐、窒息。本文0.1%抗TNF-α 和IL-1β IgY 滴鼻治療后早期過敏反應癥狀顯著減輕，抓鼻和打噴嚏次數(shù)及流涕量顯著減少(P ＜0.05)，有效地減輕了IgE 引起的早期過敏反應。IgE 促使組織胺、5-羥色胺、PGD2、LTB4、TNF-α、VEGF 等釋放，導致血管舒張、水腫、鼻癢、打噴嚏、流涕、氣道高反應等早期過敏反應［17］。

過敏性鼻炎患者及動物經(jīng)抗原攻擊后2～9 h鼻黏膜出現(xiàn)過敏晚期相反應，其主要為Th2 細胞因子增加所引起［17，18］，如IL-4、IL-5、IL-13、IL-1β、IL-33、TNF-α、TGF-β、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞增加及炎癥細胞浸潤，黏液高分泌，炎癥病理反應加劇［4，20-23］。這些炎癥因子相互作用、互為促進，致使炎癥病理反應發(fā)展，它們當中IL-1β 和TNF-α甚為重要。IL-1β 和TNF-α 能刺激鼻黏膜纖維母細胞和氣道平滑肌細胞表達IL-33，刺激氣道上皮細胞產(chǎn)生IL-6、IL-8、G-CSF、GM-CSF、RANTES、eotaxin、TARC［13，23，24］。IL-33 是IL-1β 家族成員之一，過敏性鼻炎患者血清和鼻黏膜上皮高表達IL-33，IL-33 能誘導嗜酸性粒細胞存活及超氧陰離子產(chǎn)生和脫粒，并分泌IL-8［25］。IL-33 還刺激天然Th2 細胞因子產(chǎn)生細胞(nuocytes)分泌IL-4、IL-5、IL-13，并促進氣道收縮［26］。然而有學者證明缺乏NLRP3 炎癥體和IL-1β則過敏性炎癥肺組織產(chǎn)生IL-33 也減少［27］，因此IL-1β 可能在誘導Th2 炎癥反應中起著關鍵作用，這也與我們以往的研究結果一致［12］。本文也證明0.1%抗TNF-α 和IL-1β IgY 滴鼻治療過敏性鼻炎豚鼠其NLF 和BALF 中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞顯著低于模型組(M 組)(P ＜0.05)。

過敏性鼻炎其鼻黏膜和支氣管肺組織嗜酸性粒細胞浸潤，單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、eotaxin、VCAM-1、IL-5、IL-8、IL-1β、TNF-α、TGF-β1 高 表達［4，28］。TNF-α 和IL-1β 又刺激氣道平滑肌細胞產(chǎn)生MCP-1，促進炎癥細胞浸潤、氣道平滑肌細胞增厚［29］;TGF-β1 也參與上皮細胞轉(zhuǎn)分化(EMT)［30］，導致氣道重塑;高表達的IL-33 促進過敏性哮喘患者和模型小鼠的纖維母細胞合成膠原纖維，增厚哮喘患者氣道網(wǎng)狀基底膜［31］。然而抗IL-33 抗體和抗其受體(sST2)抗體腹腔注射治療OVA 誘導的過敏性鼻炎小鼠不但顯著降低血清IgE、而且減少BALF中嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、IL-4、IL-5、IL-13 等Th2炎癥因子，減輕氣道高反應及肺組織嗜酸性粒細胞、淋巴細胞浸潤、黏液分泌和氣道重塑［32-35］。本文也證明0.1%抗TNF-α 和IL-1β IgY 治療后(Z1 組)鼻黏膜和肺組織中浸潤的嗜酸性粒細胞顯著減少(P ＜0.05);鼻黏膜及肺組織IL-1β、TNF-α、IL-5 和IL-33 表達明顯下降，炎癥病理損傷明顯減輕。這不但證明IL-1β 和TNF-α 在過敏性炎癥病理反應過程中起著啟動和加重炎癥反應的作用，而且在炎癥因子相互作用程序上也可能先于IL-33 及其他炎癥因子，因此抑制IL-1β 和TNF-α 可在很大程度上減少炎癥細胞因子產(chǎn)生和減輕炎癥病理反應的發(fā)生和發(fā)展。本文同時也提示上(鼻炎)、下(哮喘)呼吸道過敏性炎癥在病因和病理上存在著一致性，因此治療也可統(tǒng)一，這一結論與Leynaert 等［36］的研究結果一致，故抗TNF-α 和IL-1β IgY 局部被動免疫治療過敏性鼻炎有可能成為一種治療的新手段。

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